con diferentes especies de insectos, que midan la posición y velocidad de los insectos, que maximicen el uso de equipo existente, que minimicen el análisis de los datos y que sea fácil de usar.
Análisis electrofisiológico
Electroantenograma (EAG)
El EAG fue desarrollado por Schneider (1957) como un bioensayo para determinar la actividad de las fracciones separadas durante la identificación de la feromona sexual del gusano de seda, Bombyx mori. El EAG es la suma de potenciales de los receptores olfativos presentes a lo largo de la antena registrada simultáneamente por un electrodo localizado en el epitelio sensorial. El EAG registra la diferencia de potencial entre el electrodo de registro (colocado en la parte distal de la antena) y el electrodo indiferente colocado en la base de la antena. En otras palabras, cuando se tiene una antena conectada entre dos electrodos y se hace una estimulación con un compuesto biológicamente relevante al insecto en estudio, los receptores emiten una respuesta eléctrica llamada pico electroantenográfico, que es una despolarización de la membrana. De cada pico de EAG, la variable principal que se mide es la amplitud del pico, aunque también se puede medir el tiempo de recuperación. La técnica de EAG ha sido muy utilizada en estudios sobre la identificación por aproximación de feromonas de insectos, mediante la determinación de la respuesta EAG a compuestos de diferente longitud de la cadena del tentativo compuesto feromonal, y tomando en cuenta la isometría geométrica (Z o E) de la molécula. La EAG también se ha usado en estudios de dosis-respuesta y en ensayos de compuestos inhibidores de la respuesta antenal a estímulos de feromona (Roelofs, 1984).
Los primeros equipos de EAG fueron hechos en forma casera y consistían de dos electrodos hechos de hilo de plata/cloruro de plata, un amplificador de alta impedancia (1012 ohm) y un osciloscopio que permitía registrar la despolarización de la línea base (Roelofs, 1984). Sin embargo, actualmente el equipo básico de EAG está disponible comercialmente (Syntech), y consiste en una tarjeta inteligente de adquisición de datos para uso en una computadora personal, una caja de conexión de señales y una zonda en donde se colocan los electrodos, además de un par de manipuladores y un microscopio (Figura 5). La tarjeta contiene un convertidor digital-analógico de 16 bits, un amplificador, un procesador digital de señales, memoria buffer y un control lógico programable. La tarjeta acondiciona la señal, la amplifica, la digitaliza, la filtra y la transfiere a la computadora. La sonda contiene un preamplificador. Actualmente existen dos modelos de sonda, la primera, llamada universal, contiene soportes para electrodos de vidrio o electrodos de tungsteno; el segundo modelo de sonda usa soportes que permiten conectar la antena con un gel conductor, de este modelo existen una versión que permite conectar hasta cuatro antenas simultáneamente. Los electrodos de vidrio se llenan con una solución salina (p. ej. cloruro de sodio 7.5 g, cloruro cálcico 0.21 g, cloruro de potasio 0.35 g, y bicarbonato de sodio 0.2 g disueltos en 1 L de agua) para hacer la conexión entre la antena y el hilo de plata que transfiere la señal a la sonda. Con este sistema y el software necesario se pueden analizar muestras para EAG y cromatografía de gases acoplada a un electroantenodetector (CG-EAD), constituyéndose en una poderosa herramienta en el análisis de feromonas y de atrayentes. En el caso de CG-EAD, la tarjeta puede manejar además de la señal del EAG, señales de baja frecuencia como las señales del electrómetro del CG, y puede procesar las dos señales simultáneamente. A la fecha esta clase de equipo ha sido usado exitosamente en muchos laboratorios de ecología química alrededor del mundo, contribuyendo fuertemente a la identificación de nuevas feromona y kairomonas de insectos.
Figura 5. Esquema de la técnica electroantenografia (EAG) (Tomada de Syntech).
Registro unicelular
Los primeros registros de células sensoriales fueron obtenidos del sensulo tricoideo de las antenas de escarabajos y palomillas (Schneider et al., 1964). Posteriormente, se reportó la técnica de registro extracelular que consiste en conectar el electrodo de registro a la punta del sénsulo y el electrodo indiferente a la base de la antena (Kaissling, 1974). Esta técnica permite medir la actividad y la excitación o inhibición de una neurona olfativa a un compuesto. Cuando varias neuronas olfativas están localizadas en un mismo sénsulo, pueden ser discriminadas por su potencial de acción (espiga), forma y amplitud. La técnica de registro unicelular es más complicada que la técnica de EAG. Actualmente el equipo para hacer registros unicelulares puede ser adquirido de Syntech, y usa un sistema de adquisición de datos inteligentes (IDAC-4) similar al descrito para el equipo de EAG, sólo que la señal emitida por la neurona olfativa es amplificada × 1000 veces. El convertidor A/D y los circuitos de control para el IDAC-4 están contenidos en una caja de 19 pulgadas, la cual es conectada a la computadora vía un cable USB. Además, por lo general el equipo cuenta con un par de bocinas para escuchar el sonido de las señales (espigas eléctricas) emitidas por las células receptoras cuando son estimuladas. Esta respuesta es comparada con el número de señales emitidas por el sénsulo al ser estimulada por aire. Los resultados de registros de células sensoriales se pueden mostrar de dos formas, una de manera directa enseñando el gráfico obtenido ante cada estímulo y comparado contra el del aire. La segunda opción es tomando en cuenta que en esta técnica, generalmente el tiempo de estimulación es de 20 segundos, y con la ayuda de un software especializado se puede determinar el número de espigas emitidas por sénsulo por segundo para un estímulo determinado y compararlo contra el número emitido al aire. Las células sensoriales son conectadas por medio de microelectrodos de tungsteno o usando microelectrodos de vidrio llenos con una solución salina. La composición de la solución salina parece ser más importante en los registros de unicelulares que en los de EAG. La principal ventaja de los microelectrodos de tungsteno es que las conexiones son fácilmente logradas con sénsulos que están densamente empaquetados o son muy pequeños, mientras que la principal ventaja de los microelectrodos de vidrio es que se pueden lograr registros de bajo ruido debido a la baja impedancia eléctrica creada entre la hemolinfa y la solución salina (Bjostad, 1998).
Cromatografía de gases acoplada a un electroantenodetector (CG-EAD)
Un avance notable en la identificación de feromonas y atrayentes de insectos ocurrió cuando se acopló el EAG a un cromatógrafo de gases (CG), funcionando el EAG como un segundo detector, llamado detector antenal. El primer registro de CG-EAD fue reportado por Moorhouse et al. (1969) con el lepidóptero Diparopis castanea. Quienes evaluaron el extracto de la feromona sexual producida por hembras con antena de machos. Sin embargo, y a pesar de que la resolución de los picos cromatográficos no fue buena debido a que en aquellos años la CG utilizaba columnas empacadas, los autores encontraron que las antenas de los machos respondieron consistentemente a tres picos del extracto de las hembras. En este trabajo se sentaron las bases para el desarrollo posterior de la técnica y fue Arn et al. (1975) quienes reportaron un CG-EAD usando una columna capilar en cuyo extremo final se acopló un conector de vidrio en forma de T. Con la ayuda de este dispositivo, una parte de la muestra inyectada y separada pasa directamente al detector de ionización de flama (DIF) del CG usando una línea de transferencia (columna capilar de vidrio sin fase) y la otra parte al EAG (en una relación 1:1). Para evitar problemas de condensación de la fracción de muestra que va en la línea de transferencia al EAG, fue calentada a 200 ºC, y para evitar que la muestra llegue caliente a la preparación antenal, se incorporó un flujo de aire humidificado justo antes de que la muestra llegue a la antena. Con la ayuda del GC-EAD, Arn et al. (1975) confirmaron que el (E, Z)-7,9-acetato de dodecadienilo era un componente importante de la feromona sexual de Lobesia botrana, plaga importante de uvas en los países mediterráneos.
El sistema de calentamiento para evitar la condensación del efluente está disponible comercialmente (Altech Associates, Supelco, EUA, y Syntech, Alemania). Igualmente existen conectores vendidos por una compañía Australiana (SGE Analytical Science) para separar la muestra que va al DIF y al EAG. El primer tipo de conector (variable outlet Splitter,) es de acero inoxidable y tiene una separación ajustable de 5:1 a 1:1000 a una temperatura de 300
