анализировать гены – по одному, все одновременно или же вид за видом?
Последовательность 16S рРНК занимает важное место в новейшей истории биологии: этот фрагмент стал стандартным инструментом первой стадии анализа микробиома. Собственно, первые работы с 16S рРНК начались еще до того, как можно было секвенировать всю последовательность. Карл Вёзе, умерший в 2012 году, давно использовал ее для того, чтобы заново нарисовать всю карту жизни. Еще в 1970-е годы он начал сравнивать последовательности коротких фрагментов РНК – олигонуклеотидов – у различных бактерий. Выстраивая взаимосвязи между микроорганизмами и «генеалогическими деревьями» этих последовательностей, в конечном счете удалось кардинальным образом пересмотреть всю структуру жизни на Земле. Вёзе обнаружил существование третьего домена (надцарства) живых организмов (входящие в него существа теперь именуются археями), довольно сильно отличающегося от двух доменов, которые уже были известны, – бактерий и эукариот (существ более крупных, имеющих клеточное ядро). Археи, как и бактерии, являются прокариотами. Раньше ученые полагали, что все прокариоты – сравнительно близкие родственники. Но археи заметно отличаются от бактерий. Поначалу их считали существами экзотическими, обитающими лишь в самых необычных местах, но теперь-то нам известно, что археи есть повсюду, в том числе в нашем микробиоме.
Добавление нового подразделения в совокупность всех живых организмов заставило переписать учебники и утвердило секвенирование 16S рРНК в качестве одного из ключевых методов микробиологического анализа. Однако первые работы Вёзе основывались на секвенировании фрагментов РНК, полученных из чистых культур. Более современный 16S-анализ идет еще дальше, позволяя исследователям отбирать ДНК-последовательности, создающие 16S рРНК, из невероятной мешанины живых организмов.
Основная идея остается той же, однако на практике осуществить ее непросто. Работа состоит из нескольких стадий: клетки образца «вскрывают», из них извлекают ДНК, затем обнаруживают все 16S-гены при помощи ДНК-праймеров, распознающих участки в начале или в конце гена, совершенно одинаковые для всех видов. Затем ДНК-фрагменты, помеченные этими праймерами, проходят циклическую обработку. Метод, изобретенный в 1980-х и названный полимеразной цепной реакцией (ПЦР), позволяет быстро и многократно копировать небольшие количества ДНК. И наконец – собственно секвенирование.
Финальная стадия – сравнение изменчивых участков генетических последовательностей 16S с уже известными нам участками (можно сравнивать как один участок, так и несколько) – сегодня отдана компьютерным программам, имеющим базы данных ДНК, где содержатся десятки тысяч таких последовательностей. То, над чем некогда мучились бесчисленные аспиранты, теперь автоматизировано (как и большинство рутинных процедур современной молекулярной генетики). Можно прикрепить небольшие отрезки многих таких последовательностей к «биочипу» – ДНК-аналогу микросхемы – и проводить
