мониторинга динамических процессов в живых клетках (определение концентрации неорганических ионов, рН, активных форм кислорода и мембранного потенциала). Флуоресцентные красители также широко применяются при определении целостности клеток, при изучении эндо- и экзоцитоза, текучести мембран, межклеточной коммуникации и ферментативной активности клеток. Флуорохромы, взаимодействующие с нуклеотидами, нашли широкое применение в области молекулярной генетики и при проведении цитогенетических исследований.
Использование лазерной конфокальной микроскопии для изучения объектов, подвергнутых окраске флуоресцентными красителями, дает возможность определять локализацию специфических молекул и органелл с высокой точностью. Сочетание нескольких красителей и флуоресцентных меток с различными параметрами излучения позволяет проводить двойную, тройную (и более) маркировку с целью обнаружения нескольких молекулярных компонентов в одном образце.
Некоторые низкомолекулярные органические красители проявляют сродство к определенным биомолекулам и клеточным органеллам. Это явление используется для селективной флуоресцентной окраски. Так, например, амилоидные структуры флуоресцируют при взаимодействии с тиофлавинами (Коржевский Д. Э. [и др.], 2013). Флуоресцентный краситель Нильский красный (Nile Red) используется для определения локализации нейтральных липидных включений в клетках. Nile Red имеет яркую флуоресценцию в неполярных средах (максимумы возбуждения/излучения 552/636 нм). Красители BODIPY также используются при окраске нейтральных липидов. Отложения солей кальция в костях, хрящах и минерализованных опухолях при взаимодействии с тетрациклином проявляют желтую флуоресценцию. Для окраски митохондрий клетки инкубируют с красителями Mitotracker, которые пассивно диффундируют через плазматическую мембрану и накапливаются в митохондриях живых клеток. Помимо митохондриальных маркеров синтезированы также красители Lysotracker, выявляющие лизосомы. Краситель DiOC6 применяется для селективного окрашивания эндоплазматической сети. С аналогичной целью используют соединения из группы ER-Tracker.
2.1. Ядерные флуоресцентные красители
Для облегчения идентификации клеток и тканей, а также для определения положения, формы клеток, их апоптозных изменений, фазы митотического цикла в исследованиях, проводимых с применением лазерной конфокальной микроскопии и обычной флуоресцентной микроскопии, используется окраска ядер клеток соответствующими флуоресцентными красителями. Окрашивание ядра клетки значительно облегчает ориентировку в изучаемых препаратах и позволяет регистрировать ряд морфологических параметров, связанных с функциональным состоянием клетки (размеры ядра и ядрышка, состояние хроматина).
При флуоресцентной микроскопии ядерную ДНК, как правило, окрашивают DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндолом). DAPI специфически связывается с ДНК и обладает синей флуоресценцией при возбуждении ультрафиолетовым светом ртутной лампы. При проведении конфокальной микроскопии флуоресценцию DAPI необходимо возбуждать ультрафиолетовым
