постановки РСК исследуемая сыворотка прогревается на водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 мин для инактивации в ней собственного комплемента, а затем разводится, начиная с 1:5.
Рис. 7. Реакция связывания комплемента: I – положительная; II, III – отрицательные; Ат – антитело; Аг – антиген; К – комплемент; Эр – эритроциты барана
Антигеном для РСК могут быть культуры убитых бактерий, их лизаты, экстракты из патологически измененных и нормальных органов, тканевые липиды, вирусы и вируссодержащие материалы. Сухой комплемент или свежая сыворотка морской свинки перед титрованием разводится 1:10. Гемсистема, или смесь равных объемов гемолитической сыворотки в тройном титре и 3 %-ной взвеси бараньих эритроцитов по осадку, для сенсибилизации эритроцитов выдерживается в термостате при температуре 37 °C в течение 30 мин.
Перед постановкой РСК комплемент и антиген титруются. Необходимость в титровании комплемента диктуется тем, что его содержание в крови морских свинок непостоянно. Для этого основной раствор комплемента (1:10) разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл и в каждую из них прибавляют 0,85 %-ный раствор натрия хлорида, доводя объем до 1,5 мл. Пробирки ставят в термостат при температуре 37 °C на 45 мин, после чего к ним добавляют гемсистему и вновь инкубируют в термостате 30 мин. Затем определяют титр комплемента – наименьшее его количество, вызывающее гемолиз (табл. 2).
Если, например, он будет составлять 0,25 мл, то в РСК вводят рабочую дозу комплемента, которая на 20–30 % выше титра, т. е. используют следующую дозу (0,3 мл), вызвавшую полный лизис эритроцитов, доводя ее до 0,5 мл изотоническим раствором натрия хлорида.
Таблица 2.
Схема титрования комплемента
Необходимость в титровании антигена, используемого в РСК, связана с тем, что он может адсорбировать некоторое количество комплемента, т. е. обладать антикомплементарными свойствами. Для определения титра антигена его разливают в ряд пробирок в уменьшающихся дозах от 0,5 до 0,05 мл и добавляют 0,85 %-ный раствор натрия хлорида, доводя объем жидкости до 1 мл. Затем в каждую пробирку доливают по 0,5 мл рабочей дозы комплемента и помещают их в термостат на 1 ч при температуре 37 °C. После этого во все пробирки добавляют по 1 мл гемсистемы, вновь инкубируют в термостате 1 ч и учитывают результаты (табл. 3).
Таблица 3.
Схема титрования антигена
Титром антигена считается его наименьшая доза, при которой наступает полный гемолиз. В РСК используют рабочую дозу антигена, составляющую примерно 1/2-2/3 титра. Если титр комплемента в присутствии антигена снижается более чем на 30 %, то он непригоден для реакции.
Оттитровав комплемент и антиген, ставят основной опыт РСК (табл. 4).
Для этого берут три пробирки, в каждую из них вносят по 0,5 мл соответствующих ингредиентов.
На начальном этапе в первую (опытную) наливают все три компонента РСК –
