свойств рестриктазы стали незаменимым инструментом в исследовании генома, своеобразным скальпелем для ДНК.
Большой удачей для экспериментаторов было то, что в большинстве случаев при нарезании рестриктазами ДНК образующиеся фрагменты содержат «липкие» концы, т. е. способны в дальнейшем соединяться друг с другом. Для восстановления химической связи таких слипшихся фрагментов стали использовать еще один новый класс ферментов – лигазы. Так появились первые инструменты, позволяющие целенаправленно манипулировать с молекулами ДНК in vitro. Следующий важный этап – размножение сконструированных рекомбинантных ДНК, чтобы можно было с ними работать дальше. Для этой цели стали использовать специальные ДНК – векторы, которые представляют собой или бактериофаги, или внехромосом–ные кольцевые молекулы – плазмиды, которые обладают способностью размножаться в бактериальных клетках. Если любой фрагмент ДНК внести в состав ДНК бактериофагов или плазмид, то при переносе в бактериальные клетки он будет там размножаться вместе с вектором. Наконец, были разработаны специальные подходы для отбора бактериальных клеток, в которых содержатся необходимые ре–комбинантные ДНК. Все эти достижения позволили проводить клонирование ДНК, т. е. выделять из сложной смеси молекул определенные участки ДНК и размножать их.
Клонирование фрагментов ДНК дало в руки исследователей принципиально новый подход к выделению из сложной смеси ДНКовых фрагментов конкретных индивидуальных последовательностей. При этом они могли содержать осмысленные тексты (гены) или не содержать таковых. Традиционная биохимия не могла обеспечить подобную процедуру в силу того, что различные фрагменты ДНК химически очень сходны. Но генной инженерии это оказалось вполне под силу. Схематически процесс клонирования ДНК изображен на рис. 13.
После разрезания ДНК на фрагменты с помощью рестриктазы все они соединяются ковалентно с вектором (вектор разрезан той же рестриктазой) в результате «слипания» концов молекул и последующей обработки «гибридов» лигазой. Так в пробирке создается искусственная или рекомбинантная ДНК. Затем осуществляют перенос множества образовавшихся рекомбинантных молекул в бактериальные клетки – трансформацию. Особенность процесса трансформации заключается в том, что в одну бактериальную клетку попадает лишь одна рекомбинантная молекула ДНК. После этого, благодаря отбору, размножаются только бактерии с рекомбинантными ДНК, содержащими требуемые нуклеотидные последовательности.
Для изучения структуры генома необходимо не только клонировать все его участки в виде рекомбинантных молекул, но, главное, расшифровать в них последовательность нуклеотидов, т. е. «прочесть» ДНКовый текст.
Важным моментом во всей этой генно–инженерной «кухне» было создание принципиально новой технологии размножения индивидуальных фрагментов ДНК
