целом, BER – чрезвычайно действенный барьер мутациям оснований. Ярким примером этого является тройная система защиты ДНК от окисления гуанинов, выявленная как у Е. сoli, так и у высших эукариот, включая человека.
Известно, что окислению может подвергаться не только уже встроенные в цепь ДНК нуклеотиды, но и их предшественники. Окисление dGTP приводит к образованию 8-окси-dСТР, но клетка содержит специализированную dGTPaзy – белок MutT, обладающий повышенным сродством к 8-окси-dGTP. Этот белок гидролизует 8-окси-dGTP до 8-окси-dGMP, удаляя его из пула нуклеотидов и предотвращая его встраивание во вновь синтезируемую ДНК. Таким образом MutT E.coli и МТН1 (Mut T homologue 1) человека являются крайне интересными белками, не вовлеченных напрямую в эксцизионную репарацию оснований, но существенно снижающими уровень оксипуринов в ДНК.
Если же модифицированный предшественник 8-оксиG все же внедряется в ДНК напротив С, то такая неправильная пара опознается гликозилазой MutM E.coli (Fpg, OGG1 соответственно у дрожжей и человека), которая может удалить 8-оксиG, встроившийся напротив С, из ДНК.
Если и этого до начала репликации ДНК не произошло, то в ходе нее 8-оксиG может попытаться спариться с А. Такая пара распознается гликозилазой MutY E.coli (гомолог эндонуклеазы III, выщепляющей из ДНК тиминовые гликоли, цитозиновые гидраты и другие повреждения). Эта гликозилаза обладает лиазной активностью, удаляет А из ДНК и вносит разрыв в сахарофосфатный остов. Также она распознает пары G-C и A-G. У человека эту функцию выполняет специализированная гликозилаза MYH (Mut Y homologue).
Говоря о взаимосвязи между собой в процессе защиты ДНК от встраивания 8-оксоG нескольких параллельных путей эксцизионной репарации оснований, необходимо добавить, что механизмы репарации, участвующие в удалении из поврежденной ДНК 8-оксо-G были исследованы in vitro, то есть на бесклеточных экстрактах очищенных белков. Было обнаружено, что из транскрибируемой части ДНК 8-окси-G удаляется быстрее, чем из нетранскрибируемой. Гликозилазой, необходимой для инцизии 8-окси-G и использованной в этих опытах, была Ogg1. Таким образом, по крайней мере для одной из гликозилаз, четко показано, что при BER наблюдается преимущественное выщепление поврежденного основания из транскрибиремой ДНК, то есть тот путь BER, который начинает специализированная гликозилаза Ogg1 может быть описан как зксцизионная репарация оснований, спаренная с транскрипцией.
5.1.2. Роль PCNA в эксцизионной репарации оснований
Хотелось бы отдельно остановиться она роли PCNA в процессах репарации.
Как уже говорилось, у высших эукариот эксцизионная репарация оснований протекает двумя альтернативными путями – с коротким и длинным ресинтезируемыми фрагментами. Их еще иногда называют ДНК-полимераза-β-зависимый и PCNA-зависимый пути.
PCNA-зависимый путь репарации АР-сайтов был совсем недавно реконструирован in vitro с участием АР-эндонуклеазы (АРЕ1), RFC, PCNA, FEN1, ДНК-полимеразы– δ и ДНК-лигазы I. При репарационной реакции в этой реконструированной системе преимущественно
