swobodnie w płynie na szalce Petriego, do złudzenia przypomina skrawek zamoczonej chusteczki higienicznej nieco większy od łyżeczki.
Wyizolowana siatkówka pozostaje żywa: nadal konsumuje tlen i glukozę, syntetyzuje nowe białka i wydala produkty przemiany materii, a jej neurony zachowują aktywność elektryczną. W kolejnych kilku latach Ames i jego współpracownicy wykazali, że wyizolowane siatkówki zachowują się tak samo jak każda inna tkanka mózgu. Co ważniejsze – reagują na światło dokładnie tak samo jak siatkówki w oczach żywego osobnika.
Innowacja Dela szybko się przyjęła i na początku lat osiemdziesiątych nikt już nie badał siatkówek ciągle będących w oczach zwierząt doświadczalnych. Później okazało się, że wiele innych próbek mózgu może przeżyć badania poza organizmem zwierzęcia, jeżeli tylko będą należycie inkubowane. Wynaleziony przez Dela specjalny roztwór inkubacyjny, znany powszechnie jako roztwór Amesa, jest dziś sprzedawany przez firmę Sigma-Aldrich Corporation, czołowego dostawcę chemii laboratoryjnej[13]. Moje bardzo szacunkowe obliczenia wykazały, że przez ostatnie czterdzieści lat sprzedano około 300 tysięcy litrów tej substancji, co wystarczyłoby do zwodowania nowoczesnej fregaty. Del nigdy nie domagał się tantiem ani żadnego innego wynagrodzenia za swoje odkrycie, więc kiedy później chciał stosować sprzedawany przez Sigma-Aldrich roztwór Amesa, musiał za niego płacić.
Pierwsze kroki
Technologia Amesa bardzo mnie zainteresowała i po studiach zostałem jego współpracownikiem badawczym na Harvardzie. Doświadczenia, jakie wykonywałem pod kierunkiem Dela, były najlepszym wprowadzeniem do podstawowych badań z zakresu biologii postrzegania. Żadnych fajerwerków, żadnych eksperymentów pod tę czy inną nagrodę – tylko prawdziwa nauka i małe, ale znaczące postępy prowadzące do kolejnych odkryć.
Chcieliśmy z Amesem poznać mechanizm działania obwodów siatkówkowych i dowiedzieć się, jak neurony sterują zachowaniem komórek zwojowych. Wpadliśmy na pomysł, by poddać synapsy siatkówkowe działaniu leków wpływających na konkretne typy połączeń neuronalnych. Innymi słowy, zamierzaliśmy wywołać w układzie precyzyjnie skalibrowany wstrząs i zobaczyć, co się wydarzy.
Pierwotnie chcieliśmy ustalić, które z wielu znanych nauce neuroprzekaźników są wykorzystywane w obwodach siatkówki, jednak był to zaledwie cel pośredni. Neurony siatkówkowe łączy kilkanaście rodzajów synaps, uznaliśmy więc, że rozbierzemy ten system na części pierwsze, pomanipulujemy przy poszczególnych synapsach i zobaczymy, jak się zmienią sygnały wysyłane przez siatkówkę. Mieliśmy pytania: Czy istnieją odrębne neuroprzekaźniki powiązane z reakcją komórek typu ON i komórek typu OFF? Które neuroprzekaźniki biorą udział w pozornie magicznej zdolności wykrywania kierunku ruchomego bodźca? Czy dzięki nim odkryjemy mechanizm, który pozwala garstce neuronów w siatkówce określać kierunek ruchu postrzeganego obiektu?
Podstawowy eksperyment wyglądał bardzo prosto. Patrząc przez mikroskop, powoli opuszczałem mikroelektrodę, aż jej końcówka dotknęła powierzchni siatkówki. Wtedy, jeżeli miałem szczęście, słyszałem trzask komórki zwojowej. (Aktywność elektryczną neuronów wykrywamy, wzmacniając słabiutki sygnał wychwytywany przez mikroelektrodę). Jeżeli szczęścia nie miałem, przesuwałem elektrodę odrobinę w lewo lub w prawo, nasłuchując i czekając na głośniejsze i bardziej stabilne ciągi trzasków. Po starannym namierzeniu badanej komórki do akcji wkraczał masywny, chłodzony powietrzem stymulator optyczny, który rzutował na siatkówkę małe plamki światła. Naświetlając tak siatkówkę, słuchałem charakterystycznej odpowiedzi danego neuronu. Kiedy już poznałem ją tak dobrze, jak to było możliwe, wprowadzałem do gry dodatkowe czynniki i sprawdzałem, jak reakcja komórki się zmienia. Wszystko to odbywało się w niemal całkowitej ciemności – dozwolone było jedynie czerwone światło, jak w ciemni fotograficznej – aby ograniczyć przypadkowe pobudzenia siatkówki. Na ścieżkę dźwiękową eksperymentu składały się monotonny trzask neuronu i syk chłodzącego powietrza.
No i oczywiście pomieszczenie było nagrzane do temperatury organizmu królika, czyli 37°C. Kiedy Del projektował pierwotny eksperyment, nie wiedział, co może być ważne dla utrzymania przy życiu tkanki nerwowej poza organizmem. Uznał jednak za bardzo prawdopodobne, że jednym z takich czynników jest temperatura otoczenia, i zadbał o to, by móc ją kontrolować – wyizolowana siatkówka miała się znajdować dokładnie w takiej temperaturze jak w żywym ciele. Ale siatkówka była inkubowana w roztworze pod strumieniem tlenu, jaką więc mógł mieć pewność, że temperatura w inkubatorze nie będzie się zmieniać? Del, pedant w każdym calu, postanowił zatem stworzyć środowisko, w którym wszystko będzie miało temperaturę 37°C. I rzeczywiście wszystko – od siatkówki przez wszystkie roztwory po płyn inkubacyjny – miało taką właśnie, normalną temperaturę organizmu królika. Del kazał zbudować „cieplarnię” ogrzewaną za pomocą urządzeń zewnętrznych, dzięki którym mógł dowolnie regulować temperaturę w laboratorium. Zimą, kiedy powietrze jest suche, przebywanie w tym maleńkim pomieszczeniu przez dwanaście godzin bez przerwy nie było wielkim poświęceniem, ale w wilgotne letnie dni było znacznie gorzej. (Kiedy urządzałem własne laboratorium, jedną z pierwszych moich decyzji było znalezienie innego rozwiązania problemu kontrolowania temperatury).
W owych czasach znano już sporo neuroprzekaźników. Intrygowało nas to, że zgrubna analiza chemiczna wykazywała, iż wszystkie one są obecne gdzieś w siatkówce. Postanowiliśmy wykorzystać je w charakterze markerów neuronowych, które umożliwią nam rozpoznanie związanych z nimi komórek. Różne typy funkcjonalne neuronów wykorzystują różne neuroprzekaźniki, pomyśleliśmy więc, że zidentyfikowanie ich pozwoli zlokalizować komórki spełniające w siatkówce jakieś wyspecjalizowane funkcje.
Najdłużej znanym i najlepiej przebadanym neuroprzekaźnikiem była wówczas acetylocholina. Wiadomo też było, że w siatkówce występuje ona w wyjątkowo dużym stężeniu: w przeliczeniu na jednostkę masy siatkówka ma jej więcej niż zdecydowana większość struktur układu nerwowego. Ze wstępnych eksperymentów Dela Amesa i Daniela Pollena można było wnioskować, że acetylocholina reguluje działanie niektórych komórek zwojowych. A ponieważ neuroprzekaźnik ten znany był od dawna, istniały syntetyczne substancje wpływające na używające go synapsy.
Od razu spostrzegłem, że wprowadzenie acetylocholiny lub substancji pochodnych pobudza mnóstwo komórek zwojowych. Ich reakcje były powtarzalne: neurony pobudzane przez ten neuroprzekaźnik były również pobudzane przez czynniki, które wzmacniają jego działanie. Niektóre rodzaje komórek zwojowych wykazywały podobnie spójne reakcje na acetylocholinę, inne znów nie, trudno jednak było dostrzec w tym wszystkim jakiś sensowny wzorzec. (Najpierw sądziłem, że bardziej wrażliwe są komórki typu ON, ale wniosek ten był bardzo nieprecyzyjny. Dzisiaj wiem, że mój system klasyfikowania reakcji komórek był daleki od ideału).
Następnie zacząłem sprawdzać, które komórki siatkówki zawierają acetylocholinę. Nie było to łatwe, a możliwe tylko dzięki długiej współpracy z moim przyjacielem Johnem Millsem, niedoścignionym mistrzem techniki znakowania acetylocholiny. Niemniej na końcu tej drogi czekało na nas rozwiązanie: acetylocholinę zawiera niewielka grupa komórek amakrynowych. (Komórki amakrynowe pełnią w siatkówce funkcję interneuronów, które modyfikują iskrzenie komórek zwojowych. Opowiem o nich więcej już niedługo). Zasłynęły one później jako „fajerwerkowe” komórki amakrynowe (starburst amacrine cells), bo ich piękna symetria skojarzyła się Tedowi Famigliettiemu, obdarzonemu bujną wyobraźnią specowi od neuroanatomii, z wybuchem fajerwerkowej gwiazdy. Jak się później okazało, komórki te są głównym motorem selektywności kierunku widzenia w komórkach zwojowych siatkówki.
W tamtym okresie ukończyłem kilka innych małych projektów,
