1 расщепление ДНК осуществляется комплексом белков, иногда называемых каскадом от слова Cas. В классе 2 системы CRISPR содержат одну нуклеазу Cas, такую как Cas9, Cas12 или Cas13. (Подробнее см. пункт 15 примечаний.)
Марраффини показывает, как две бактериальные системы защиты дополняют друг друга. Рестриктазы создают первый барьер защиты от вирусной угрозы, дробя вирусную ДНК на части, которые могут быть включены в массив CRISPR. Однако, если фаги, когда-либо эволюционировавшие, уклоняются от первой линии защиты, срабатывает иммунизация CRISPR. «Это аналогично вакцинации, – говорит Марраффини. – Когда ДНК фагов мертва, CRISPR может собрать спейсеры для формирования иммунитета у бактерии». Лишь немногие инфицированные вирусом бактерии действительно приобретают спейсеры – примерно 1 на 1 млн, но это дает одной клетке возможность устранить вирусную угрозу и восстановить популяцию[70].
В документальном фильме Адама Болта «Природа человека» (Human Nature, 2019) мы знакомимся с Дэвидом Санчесом, очаровательным мальчиком, страдающим от серповидноклеточной анемии. Узнав о возможностях CRISPR в лечении его болезни, он проницательно спрашивает: «Как эта штука работает и откуда она знает, как воздействовать на нужный ген, а не на тот, что отвечает за рост волос?»
Гениальность революции CRISPR заключалась в том, чтобы привязать Cas9 не к вирусной РНК, как в природе, а к синтетически разработанной РНК, запрограммированной исследователями, которая позволяет им воздействовать практически на любую последовательность ДНК любого гена любого организма. В результате у нас в руках оказался бактериальный фермент, существующий миллиард лет, и мы перепрофилировали его в молекулярный скальпель точной генной хирургии XXI в. Независимо от того, чей геном мы хотим отредактировать: хомяка или человека, комара или мыши, красной смородины или красного дерева, – процесс остается по сути одним и тем же. Это связано с тем, что все организмы в природе используют один и тот же универсальный код ДНК, состоящий из одного и того же четырехбуквенного алфавита.
В своем естественном состоянии Cas9 не интересуется ДНК, в основном случайно сталкиваясь и отскакивая от нее. Но как только Cas9, имеющая форму ладони, захватывает направляющую РНК, точная реконфигурация структуры белка заставляет ее взаимодействовать с ДНК в поисках подходящей мишени. По словам Блейка Виденхефта, профессора Университета штата Монтана, белковые комплексы Cas «патрулируют все внутриклеточное пространство, находят чужеродную [вирусную] ДНК, связываются с ней и приговаривают ее к уничтожению в считаные минуты… это довольно впечатляющий процесс»[71].
Поиск и связывание с целевой последовательностью происходят в два этапа. Прежде всего Cas9 ищет короткий мотив ДНК, называемый последовательностью PAM[72], – маяк, который дает ферменту сигнал для кратковременного связывания с ДНК, и взаимодействует с ним. «Это мимолетное взаимодействие приводит к искривлению ДНК», – объясняет Виденхефт.
В 2020 г. группа Ротема Сорека из Научного института Вейцмана в Израиле сообщила о новой дополнительной бактериальной антифаговой системе защиты, называемой ретронами.
CSHL Leading Strand, "CSHL Keynote, Dr Blake Wiedenheft, Montana State University," YouTube video, 21:21, last viewed June 26, 2020, https://www.youtube.com/watch?v=2x5VoReHV_4&t=.
Аббревиатура PAM расшифровывается как «мотив, смежный с протоспейсером» (от англ. Protospacer Adjacent Motif). Различные ферменты Cas распознают разные PAM, от трех до шести оснований. Наиболее часто используемая Cas9 из
