университета в Швеции, подсчитал, что Cas9 обычно требуется около шести часов для обнаружения каждой последовательности PAM в бактериальном геноме с остановками на двадцать миллисекунд на каждом предполагаемом участке, чтобы заглянуть в двойную спираль и проверить, действительно ли он нашел правильную мишень[77]. Но упаковка ДНК в ядре эукариотической клетки намного сложнее, чем у бактерий. Во время лекций, проводимых для студентов в Эдинбургском университете, Эндрю Вуд показывает схему строения бактериальной клетки рядом с извилистым петляющим волокном ДНК млекопитающих. «Cas9 не создана для того, чтобы работать в той среде, в которую мы сейчас ее поместили, – говорит он. – Поразительно, что она способна рассмотреть сотни миллионов нуклеотидов за считаные часы»[78].
После того как Cas9 разрезал ДНК, репаративные ферменты ДНК клетки «зашивают» разрыв. Эксперты удивляются тому, как успешно это работает[79]. Cas9 превосходит даже ранее разработанные технологии редактирования генов ZFN и TALEN[80]. «Они были созданы, чтобы работать с эукариотической ДНК, но тем не менее, по всей видимости, Cas9 превосходит их», – говорит Вуд.
Давайте сделаем паузу и отметим решающую роль, которую играет в этом процессе последовательность PAM: поиск коротких фрагментов PAM вместо распаковки и проверки практически всего генома значительно упрощает задачу для Cas9 по фиксации целевой последовательности. Наличие PAM также объясняет то, что Cas9 не разрезает случайным образом повторы в последовательности CRISPR бактериальной ДНК. Это связано с тем, что, когда последовательности ДНК изначально добавляются к участку CRISPR в геноме бактерий, последовательности PAM отсекаются. Генные инженеры не хотят ограничиваться природным набором последовательностей PAM, поэтому модифицируют исходные ферменты Cas9 и Cas других видов бактерий, чтобы расширить их предпочтения в распознавании короткой последовательности PAM.
Если у бактерий настолько эффективна система безопасности, было бы резонно задаться вопросом: почему вирусы не вымерли? Вирусы незаметно развили множество обходных механизмов – группу белков, которые способны нейтрализовать нуклеазы Cas, известные как белки анти-CRISPR. Вирусы и бактерии подобны хищникам и их жертвам, вовлеченным в бесконечную борьбу, которая продолжается сотни миллионов лет[81]. CRISPR обнаружен в 46 % бактериальных геномов и почти во всех геномах архей, но, что удивительно, совсем не встречается в геномах высших организмов. Хотя на сегодняшний день Cas9 чаще всего используется совместно с CRISPR, являясь предметом ожесточенных патентных споров, о которых я расскажу позже, этот фермент представляет собой лишь каплю в море разнообразных систем CRISPR, встречающихся в природе. Ученые прикладывают массу усилий, чтобы изучить биологическое разнообразие на Земле, открыть новые белки семейства Cas с новыми функциями и расширить набор инструментов CRISPR[82].
После того как исследователь
D. Lawson Jones et al., "Kinetics of dCas9 target search in Escherichia coli,"
Andrew Wood, phone interview, August 28, 2019.
Rodolphe Barrangou, "CRISPR-Cas: From Bacterial Adaptive Immunity to a Genome Editing Revolution," XBio, September 2019, https://explorebiology.org/summary/genetics/crispr-cas:-from-bacterial-adaptive-immunity-to-a-genome-editing-revolution
ZNF (zinc finger nuclease) – цинк-пальцевая нуклеаза; TALEN (transcription activator-like effector nuclease) – эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции (см. главу 8).
S. Hwang and K. L. Maxwell, "Meet the Anti-CRISPRs: Widespread Protein Inhibitors of CRISPR-Cas Systems,"
M. Adli, "The CRISPR tool kit for genome editing and beyond."
