asas bacteriológicas y pinzas metálicas. Así mismo, los procedimientos de siembra y aislamiento de microorganismos se realizan cerca de la llama del mechero con el fin de evitar contaminación.I. Examen microscópico bacteriano (morfología y tinciones)
Introducción
Los microorganismos se encuentran presentes en una amplia variedad de hábitats y sustratos (vegetales, animales, suelo, agua, etc.). Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, no se pueden ver a simple vista; solo es posible observarlos mediante un examen microscópico, el cual se realiza frotando la muestra biológica en una lámina portaobjeto y contrastándola con un colorante. Básicamente, se realizan dos tipos de exámenes microscópicos: el de microorganismos vivos y el de microorganismos muertos (Valenzuela, 2007). En esta práctica de laboratorio nos centraremos en el estudio de microorganismos muertos procedentes de cultivos bacterianos existentes en el laboratorio.
Examen microscópico de microorganismos muertos
Se realiza mediante la observación microscópica de preparaciones fijadas y teñidas, las cuales ofrecen tres ventajas principales para la observación: 1) aumentan el contraste entre la célula bacteriana y el medio que la rodea, 2) permiten distinguir diferentes tipos de células bacterianas según sea su capacidad de teñirse con cualquier colorante (como por ejemplo las tinciones de Gram y Ziehl-Neelsen), y 3) permiten establecer la morfología de la célula bacteriana y de otros microorganismos, su agrupación y también algunas estructuras específicas (Valencia, 2004). Este tipo de preparaciones se basa en los siguientes procedimientos: extensión, fijación y tinción.
•Extensión: consiste en depositar asépticamente, en el centro de un portaobjeto, una gota de agua destilada y, con ayuda del asa de siembra, extraer el inóculo desde un cultivo bacteriano. Luego con el asa estéril se procede a expandir el inóculo junto con la gota de agua sobre la superficie del portaobjeto de manera que quede uniformemente repartida.
•Fijación: después de extendidas, las células bacterianas se deben adherir al portaobjeto en el cual se van a teñir. Para el caso de las bacterias, la fijación por calor es lo más común (método físico a través de la llama del mechero), pero también se recurre a compuestos químicos como formaldehído, ácido fénico, alcoholes, etc. (método químico). En esta práctica utilizaremos el calor para matar las bacterias y adherirlas al portaobjeto.
•Tinción: una vez fijada la muestra, se procede a su tinción, para lo cual se hace uso de colorantes. La mayoría de ellos son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por componentes celulares. Muchos de los colorantes utilizados corresponden a moléculas cargadas positivamente (colorantes catiónicos) como azul de metileno, cristal violeta o safranina, y se combinan con gran afinidad con constituyentes celulares cargados negativamente, tales como ácidos nucleicos y polisacáridos. También existen colorantes aniónicos (moléculas cargadas negativamente), como la eosina, que se combinan con componentes celulares cargados positivamente como proteínas. Un tercer grupo de colorantes está formado por compuestos que se combinan con los materiales lipídicos de las células y son utilizados para localizar depósitos de grasa; por ejemplo, el colorante negro de Sudán (López-Jácome, et ál., 2014).
Existen sustancias químicas denominadas mordientes, que son capaces de combinarse con algún constituyente celular y alterarlo de tal forma que sea más vulnerable a un colorante, de manera que algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con esta sustancia. Los mordientes no son colorantes por sí mismos, y algunos ejemplos de estas sustancias son el ácido fénico y el ácido tánico (Arias y Gómez, 2001).
Mediante las tinciones especiales se pueden determinar morfología, agrupación, flagelos, endosporas, etc. Aun así, es preciso
