(RPh) und indirekte Immunfluoreszenz wurden die DNA sowie Bestandteile des Cytoskeletts (F-Actin und β-Tubulin) sichtbar gemacht. So sollte eine räumliche Analyse des Furchungsmodus bzw. der Blastomerenanordnung ermöglicht werden; weiterhin sollten indirekte Rückschlüsse zur kausalen Beteiligung des Cytoskeletts an der oben beschriebenen Drehung, an Formveränderungen und an der Cytokinese gezogen werden. Es bestand die Hoffnung, den durch elektronenmikroskopische Untersuchungen postulierten kontraktilen Bogen (Abb. 1) (Schroeder 1968; Szollosi 1970) erstmals bei Coelenteraten auch fluoreszenzmikroskopisch sichtbar zu machen.
Die Hemmstoffe des Cytoskeletts Cytochalasin B und Nocodazol wurden eingesetzt, um direkte Rückschlüsse auf die eben beschriebenen Aspekte Drehung, Formveränderung, Cytokinese und Zusammenwirken der Cytoskelettelemente ziehen zu können.
Abb. 1
Schematische Darstellung der Anordnung der Filamente des kontraktilen Bogens bei der ersten Furchung des Eies von Stomatoca atra. Aus Schroeder (1968).
Oben: Räumliche Darstellung des Eies (links) und Schroeders Interpretation seiner elektronenmikrospkopischen Daten in bezug auf die Anordnung der Filamente im Ei (rechts).
Mitte und unten: Darstellung der Schnittebenen (links) und der jeweils am elektronenmikroskopischen Schnitt gefundenen Anordnung der Filamente.
2.1 Hälterung der Versuchstiere
Die verwendeten Versuchstiere wurden an der Biologischen Anstalt Helgoland (BAH) aus der Nordsee gedredged oder getaucht. Die Polypenkolonien von Hydractinia echinata wachsen auf von Einsiedlerkrebsen (Pagurus bernhardus) bewohnten Schneckenschalen (meist von Buccinum oder Littorina). Meist ist jede Schale zusätzlich von dem Polychaeten Nereis fucata bewohnt. Die meisten Einsiedlerkrebse und Nereiden wurden aus den Schneckenschalen entfernt, um die Handhabung zu erleichtern, um ein Abfressen der Polypen durch die Krebse zu verhindern und um bei der Hälterung in Berlin das Aquarienwasser nicht übermäßig mit Exkrementen und Exkreten zu belasten.
Während meines Aufenthaltes an der BAH (24.05. - 04.06.1993) wurden die Tiere tagsüber in fließendem Nordseewasser (pH 8,1; Temperatur 13° C) gehältert. Über Nacht wurden sie in belüfteten Plastikaquarien in einen Klimaraum (15° C, LD 16:8) gestellt. Alle ein bis zwei Tage erfolgte eine Fütterung mit frischem Plankton.
Der überwiegende Teil der Untersuchungen wurde in Berlin durchgeführt. Die im folgenden beschriebenen Bedingungen ermöglichten es leider nicht, geschlechtsreife Polypenkolonien über einen größeren Zeitraum als drei Monate zu erhalten. Während die Tiere unter den Bedingungen an der Biologischen Anstalt Helgoland täglich reichlich ablaichten, taten sie dies in Berlin nur in den ersten Wochen. In den Herbst- und Wintermonaten war daher kein Versuchsmaterial vorhanden.
30-40 mit Polypenkolonien besetzte, unterschiedlich große Schneckenschalen wurden in zwei miteinander in Verbindung stehenden Aquarien (Maße: 60 x 40 x 50 cm3 und 30 x 50 x 30 cm3) in ca. 100 l synthetischem Meerwasser, pH 8,1, bei 17° C (Plusminus 1° C), LD 16:8 gehältert. Das synthetische Meerwasser wurde mit dem Meersalz "Biosal" (Fa. Aqualine Buschke) und Aqua dest. auf eine Dichte von 1,024 g/cm3 (bei 25° C) angesetzt und ca. 3 Wochen bis zum Gebrauch stehengelassen. Drei Wochen vor der Besetzung mit Tieren wurde das Aquarium mit 2 Filtern (Fa. Eheim, Typ 2213 und Typ 2214, Filtermassen: Korallenbruch, Ehfisubstrat, Filterkohle, Filterwatte) ausgestattet in Betrieb genommen. Der Boden der Aquarien wurde mit grobem und feinem Korallenbruch ca. 2 cm hoch bedeckt.
Die Fütterung der Tiere erfolgte alle ein bis zwei Tage in einem separaten Plastikaquarium in einem Volumen von ca. 2,5 l bei guter Durchmischung. Das Futter bestand aus einem Gemisch aus stark zerkleinertem Seelachs- u. Krebsfleisch, Bosmiden (alles Tiefkühlware) sowie lebenden, mindestens fünf Tage alten Naupliuslarven von Artemia salina. Nach der Fütterung wurden die Polypenkolonien in weiteren 2,5 l Meerwasser gereinigt. Das verwendete Wasser wurde stets aus den Aquarien entnommen; aus Sparsamkeitsgründen wurde als Reinigungswasser das Wasser verwendet, in welchem Hydractinia vorher abgelaicht hatte. Die verbrauchten fünf Liter wurden durch Zugabe von frischem synthetischen Meerwasser in die Aquarien ersetzt.
2.2 Gewinnung der Zygoten
Das Einsetzen der Beleuchtung nach einer Dunkelphase löst bei Hydractinia echinata das Platzen der reifen Gonophore aus, was bei 17° C nach ca. 80-100 min erfolgt (die Dauer des Ablaichens beträgt also ca. 20 min). Die Polypenkolonien beider Geschlechter wurden 1 h nach Beleuchtungsbeginn zum Ablaichen für die Dauer von 1,5 h zusammen in eine runde Glasschale in ca. 2,5 l Meerwasser überführt und danach wieder entfernt. Die Zygoten wurden anschließend durch Schwenken der Schale konzentriert, mit einer Pipette abgesammelt und zweimal in synthetisches, zuvor bei 80° C pasteurisiertes Meerwasser überführt (auf Helgoland wurde Millipore-gefiltertes Meerwasser benutzt).
2.3 Behandlung und Beobachtung der Keime
Die Lebendbeobachtungen und Versuche erfolgten bei 19° C. Für kurzzeitige Beobachtungen unter dem Stereomikroskop wurden einzelne Keime in einen Tropfen Meerwasser auf einem Objektträger überführt. Die optische Qualität ist so bei entsprechender Beleuchtung (s.u.) am besten. Da die Keime von Hydractinia jedoch mit Fehlentwicklungen, Fragmentierung und Entwicklungsstopp reagieren, wenn die Beobachtung über längere Zeit in einem solch geringen Wasservolumen durchgeführt wird, wurden für längere Beobachtungen Objektträger verwendet, die mit einem Rand aus vierkantigen Kunststoffstreifen beklebt waren (Klebstoff: ungiftige, spritzbare Gummidichtung "FD-Plast E", Compakta Werke Traunreut) und so ein Fassungsvermögen von ca. 3 ml aufwiesen. Die Keime durften nicht zu dicht liegen, da sie sonst durch ihre aufquellende, nicht sichtbare Gallerthülle in einer Art Gelee eingebettet waren, das ihre freie Beweglichkeit einschränkte.
Die frühe Entwicklung wurde mindestens bis zum 8-Zell-Stadium beobachtet, Zeichnungen wurden angefertigt.
2.4 Aufbringen von Farbmarkern
Um Bewegungen und Drehungen der Keime verfolgen zu können, wurden bei Beginn der ersten Furchung möglichst kleine Partikel des Farbstoffes Neutralrot mit einer feinen Glasnadel auf die Oberfläche der Keime aufgebracht. Mindestens bis zum Ende der zweiten Furchung wurden dann in kurzen Zeitabständen Zeichnungen angefertigt. Auf diese Weise war es möglich, 5 - 15 Keime pro Tag zu protokollieren. Eine solche Anzahl von Keimen konnte man nicht ununterbrochen gleichzeitig beobachten, die Bewegung wurde also aus den Momentaufnahmen der Zeichnungen rekonstruiert. Die für eine eindeutige Rekonstruktion günstigsten Markierungsbereiche sind in Abb. 2 dargestellt.
Abb. 2
a: Die am besten geeigneten Bereiche zur Vitalmarkierung des sich furchenden Hydractinia-Eies sind durch Schraffur hervorgehoben. Markierung in diesem Bereich erleichtert die Interpretation bezüglich einer Drehung des Keims mit dem animalen Pol nach oben oder unten. b: Zur Begriffsbestimmung und Orientierung. Bl = entstehende Blastomeren; Fk = Furchenkopf (Furchenspitze, Furchenfront); A = animaler Pol; V = vegetativer Pol.
