из фильтровальной бумаги диаметром 8 мм заготавливают впрок, стерилизуют в автоклаве под давлением выше нормального на одну атмосферу в течение 30 мин.
Стерильный диск фильтровальной бумаги захватывают стерильным пинцетом и смачивают в испытуемой культуральной жидкости, затем накладывают на поверхность питательного агара, засеянного тест-микробом. Чашку с тесторганизмом и бумажными дисками помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста тест-организма, на 24 ч, если это бактериальные формы тест-микроба, и на промежуток времени от 48 до 72 ч для грибных или дрожжеподобных форм.
При наличии антибиотического вещества в испытуемой культуральной жидкости вокруг диска образуется зона задержки роста тест-микроба.
Приведенные методы пригодны для определения антибиотической активности микроорганизмов только в отношении бактерии, актиномицетов, дрожжевых и дрожжеподобных организмов и грибов. Для выяснения антивирусного или антиопухолевого действия организмов в силу специфичности этих объектов используют другие методы, описанные в 3.7.3, 3.7.4.
3.7.3 Определение антивирусного действия антибиотиков
Вирусы – внутриклеточные паразиты и поэтому не могут развиваться в виде «чистой культуры» вне клеток своего хозяина. Это обстоятельство и заставляет применять другие методы первоначального отбора активных веществ, отвечающие особенностям развития вирусов.
Метод тканевых культур . Существует несколько вариантов метода тканевых культур, но наиболее удобен метод использования переживающих кусочков хорион-аллантоисной ткани куриного эмбриона в модификации Тама, Фалкерса и Хорсфолла (1953).
Из верхней части куриного яйца с 10-11-дневным эмбрионом вырезают стерильными ножницами шесть кусочков скорлупы с прилегающей к ней тканью хорион-аллантоисной оболочки. Кусочки ткани осторожно отделяют от скорлупы и промывают буферным раствором. Каждый такой кусочек ткани помещают в пробирку с 1 мл среды следующего состава, в процентах (%): NaCl – 0,68, KCl – 0,04, CaCl2 – 0,02, MgSO4 – 0,01, NaH2PO4 – 0,0125, NaHCO3 – 0,22, глюкоза – 1,0.
Кроме того, в каждую пробирку добавляют пенициллин (100 ед/мл), с тем чтобы предохранить ткань от загрязнения (развития микроорганизмов). Пробирки устанавливают в специальный медленно (около 12 об/ч) вращающийся барабан.
Для выяснения антивирусного действия продуктов жизнедеятельности определенного организма кусочки ткани заражают соответствующим видом вирусов и вносят в пробирки, содержащие культуральную жидкость (при рН 7,0) исследуемого организма. Пробирки помещают в барабан на 48 ч.
Если культуральная жидкость обладает антивирусным действием, то в среде, окружающей ткань, не будет обнаружено вируса. При отсутствии антивирусного действия вирусы будут интенсивно размножаться в клетках ткани, что может быть легко обнаружено методом титрования на эритроцитах.
Метод оценки антивирусных свойств
