de manera general, ya que no pretendemos escribir sendos tratados sobre estas técnicas, pues existen libros en inglés que lo hacen a profundidad.
Introducción
La comunicación química juega un importante papel en casi todos los aspectos de la vida de los insectos, incluyendo la localización de alimento y parejas potenciales, y en la detección de depredadores, entre otras funciones. Los compuestos químicos conllevan una cantidad asombrosa de información, así que uno de los mayores retos es determinar cómo ocurre la comunicación entre los diferentes individuos y su ambiente. Los insectos y plantas liberan compuestos volátiles que pueden afectar la fisiología y comportamiento de los insectos. En años recientes ha habido un gran interés en identificar los volátiles emitidos por insectos y plantas, y entender su efecto en las interacciones intraespecíficas (p. ej. macho-hembra, reina-obrera) e interespecíficas (p. ej. planta-planta, planta-insecto herbívoro, planta-insecto herbívoro-parasitoide).
La identificación de la primera feromona sexual de un insecto, producida por las hembras del gusano de seda para atraer a los machos, fue anunciada por el químico alemán Adolf Butenandt en 1959 (Hecker & Butenandt, 1984). Este investigador ganó el premio Nobel de química en 1939 por haber identificado las hormonas sexuales humanas, estrona, progesterona y testosterona. La identificación de la primera feromona de un insecto fue una tarea bastante difícil ya que para lograrlo se tuvieron que disecar lotes de hasta 500,000 abdómenes de las hembras de Bombyx mori para tener el material suficiente para aislarla en cantidades apropiadas y elucidar su estructura química. Básicamente para el aislamiento de la feromona se usó cromatografía en columna y en capa fina con sílica gel. La elucidación de la estructura de la feromona se logró usando análisis por espectrometría UV, espectrometría de infrarrojo y microrreacciones. Sin embargo, para ver si la estructura era la correcta fue necesario sintetizar la molécula en sus cuatro posibles configuraciones (Z o E) y evaluarlas en bioensayos comportamentales. La feromona fue identificada como (E-10, Z-12) hexadecadienol, bombicol, y el trabajo para identificarla tomó dos décadas.
Actualmente gracias al importante desarrollo en las técnicas analíticas modernas es posible identificar un semioquímico en un tiempo menor y con menos material biológico de lo que se usó para identificar la primera feromona. En este capítulo describiremos una serie de métodos de colecta de muestreo, de aislamiento e identificación de semioquímicos, con énfasis en los compuestos volátiles.
Métodos de muestreo de semioquímicos
En esta sección haremos una breve descripción de los métodos usados para el muestreo y la concentración de compuestos volátiles y no volátiles. Básicamente los compuestos pueden ser extraídos sumergiendo una parte del insecto (p. ej. glándula) o planta (p. ej. hoja, raíz) en un disolvente o muestreando la fase gaseosa (“headspace”) alrededor del organismo. Cuando hacemos una extracción con disolventes podemos extraer compuestos volátiles y no volátiles. El muestreo puede ser estático o dinámico, en ambos casos los volátiles son desorbidos con algún disolvente o mediante calentamiento. La selección del método dependerá del problema biológico y del material que se desea investigar. Por ejemplo, si deseamos evaluar la actividad biológica de algún extracto, entonces debemos hacer la extracción con disolventes o usando un método de aeración en donde los volátiles atrapados puedan ser eluídos con disolventes.
Extracción con disolventes
En este método los compuestos de interés pueden ser extraídos sumergiendo los tejidos del material biológico en estudio en un disolvente por un determinado tiempo o bien pueden ser extraídos con un Soxhlet. El tiempo de extracción dependerá del tipo de compuestos que deseemos extraer. Por ejemplo, si queremos extraer los lípidos cuticulares de un tejido, entonces con sumergir el material unos cuantos segundos o minutos será suficiente, pero si estamos interesados en extraer compuestos internos de los tejidos, entonces el material deberá permanecer en el disolvente varias horas o días. En algunos casos se calienta el disolvente para acelerar el proceso de extracción, esto se hace cuando se intenta extraer compuestos no volátiles o compuestos que no se degradan con el calor. El método de extracción con disolvente ha sido ampliamente usado para extraer las feromonas sexuales de lepidópteros, básicamente consiste en estrujar el cuerpo de la hembra, de tal forma que expongan los últimos segmentos abdominales en donde se encuentran las células productoras de la feromona, los cuales son cortados y sumergidos en un pequeño vial conteniendo 200 μL de hexano o cloruro de metileno durante minutos a una hora. Entre menos tiempo permanezca el tejido en el disolvente, menos posibilidades habrá de extraer lípidos, que pueden interferir con el análisis químico de los extractos. Este método también ha sido usado ampliamente para extraer hidrocarburos cuticulares y metabolitos secundarios de las plantas que mediatizan el comportamiento de alimentación y oviposición de los insectos. Cuando se use este método se debe tener cuidado de utilizar un disolvente limpio grado HPLC y lavar perfectamente los recipientes de vidrio utilizados para la extracción.
Muestreo de volátiles
En esta sección describiremos brevemente los métodos para muestrear los compuestos volátiles.
Aireación dinámica
La aeración dinámica es el método más usado para muestrear los volátiles emitidos por insectos y plantas. Este método consiste en pasar un flujo de aire para arrastrar los compuestos volátiles emitidos por el organismo, el cual está contenido dentro de un recipiente y capturarlos en filtros con adsorbentes (Heath & Manukian, 1992). Los recipientes usados para contener el material a muestrear pueden ser de vidrio o de plástico, los primeros tienen menores niveles de impurezas, pero son más caros y frágiles, los segundos son más versátiles y pueden ser muy útiles para la captura de volátiles de plantas en el laboratorio y en campo. Se han usadas bolsas de diversos materiales en diferentes trabajos, incluyendo polietileno, poliéster, poliacetato, polietileno de tereftalato y polivinilacetato (Stewart-Jones & Poppy, 2006). También diferentes adsorbentes para la captura de volátiles de insectos y plantas, los más utilizados son Porapak Q, Super Q, Tenax y carbón activado. Algunos adsorbentes como Porapak Q o Tenax necesitan ser tratados antes de usarse debido a las impurezas que contienen o bien usar versiones más limpias de estos adsorbentes tales como Super Q y Tenax TA. El tratamiento de los adsorbentes consiste en colocarlos dentro de un tubo de vidrio y calentarlos a 200 (Porapak Q) o 270-340 ºC (Tenax) durante varias horas pasando un flujo de N2 dentro del tubo para evitar que el adsorbente se queme, posteriormente el adsorbente es lavado con pentano, cloruro de metileno o éter usando un Soxhlet (Millar & Sims, 1998). Los adsorbentes son usualmente contenidos o empacados dentro de tubos de vidrio (p. ej. una pipeta Pasteur) con lana de vidrio o malla metálica. Los tubos empacados con adsorbente pueden ser obtenidos de casas comerciales tales como SKC y ARS en los EUA, la primera compañía tiene distribuidores en varios países de Latinoamérica y la segunda puede ser fácilmente contactada vía Internet. El aire que arrastra los compuestos volátiles pasa a través del adsorbente a una tasa de flujo constante durante el proceso de muestreo.
Los sistemas de colecta que muestrean los volátiles por aeración dinámica pueden ser cerrados o abiertos (Tholl et al., 2006). En el sistema del primer tipo, conocido en inglés como “closed-loop stripping”, el aire junto con los volátiles emitidos por el organismo se hacen circular mediante una bomba de diafragma y capturados en el adsorbente dentro de una cámara cerrada (p. ej. desecador de vidrio de 750mL) (Seidelmann et al., 2000) (Figura 1). Los contaminantes son minimizados debido a que el aire circula dentro de un ambiente cerrado. Los volátiles atrapados pueden ser recuperados con disolventes o termodesorbidos. Un modelo comercial de este sistema es vendido por Brechühler AG, una compañía de Suiza. Este sistema ha sido usado para muestrear feromonas de insectos y volátiles vegetales inducidos por herbivoría y volátiles florales (Bestmann et al., 1988; Tholl et al., 2006).
Figura
