Fraktionsvolumen von etwa 333 μl. Als Injektionsvolumen für die 2D-Trennung ist diese Menge selbst für die größten heute gebräuchlichen analytischen Säulen (z. B. 150 mm × 4,6 mm Innendurchmesser) zu groß und wird die Qualität der 2D-Trennung erheblich beeinträchtigen. Dies ist der erste Punkt, an dem eine wichtige Entscheidung getroffen werden muss. Wir haben drei Hauptoptionen (Leser, die sich für nähere Einzelheiten interessieren, werden auf die neuere Literatur verwiesen; siehe [15]):
1 1. Injizieren Sie die gesamte Fraktion, wie sie ist, in eine große 2D-Säule und hoffen Sie auf das Beste. Dies funktioniert gut in Fällen, in denen der Zielanalyt aus der 1D-Säule in einem Eluat enthalten ist, welches ein schwaches Lösungsmittel für die 2D-Säule darstellt (z. B. 1D-Eluat mit 10/90 ACN/Wasser, der in eine mobile 2D-Phase mit 20/80 ACN/Wasser injiziert wird), aber dies ist nicht immer möglich oder praktikabel.
2 2. Injizieren Sie einen kleineren Anteil des 1D-Peaks, um das Fraktionsvolumen handhabbarer zu machen (z. B. 40 μl). Dieser Ansatz löst das Problem des Injektionsvolumens, führt aber möglicherweise zu neuen Problemen:a) es besteht die Gefahr, dass Analyten fehlen, die im vorderen oder hinteren Teil des 1D-Zielpeaks eluieren, undb) die Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes ist nicht gut, da er empfindlich auf kleine Verschiebungen der 1D-Retentionszeit reagiert.
3 3. Die Option, die dem Analytiker die größte Kontrolle bietet, ist die Verwendung einer aktiven Modulationstechnik, um die Auswirkungen des großen Fraktionsvolumens auf die 2D-Trennung zu steuern. Die gängigsten Ansätze sind:• Verdünnung des 1D-Eluats mit schwachem Lösungsmittel unter Verwendung einer zusätzlichen Pumpe (z. B. Verdünnung mit Wasser im Falle einer RP-Trennung in der zweiten Dimension)• Aktive Lösungsmittelmodulation unter Verwendung eines Ventils zur Anpassung der 1D-Fraktion• Verwendung einer „Adsorptionsfalle“ zur Trennung der interessierenden Analyten von der 1D-Matrix vor der Injektion in die 2D-Säule.
Nachdem das geeignete Volumen der 1D-Fraktion und der Ansatz zur Übertragung dieser Fraktion in die zweite Dimension gewählt ist, können die Dimensionen und Bedingungen für die 2D-Säule festgelegt werden. Im Falle einer LC-LC- Trennung wie der in diesem Szenario beschriebenen, hat der Analytiker in der zweiten Dimension eine große Flexibilität, und die meisten Regeln, die wir für die Auswahl der Säulen und Bedingungen in 1D-LC verwenden, gelten auch hier. Die Säulenlänge, die Partikelgröße und die Flussrate werden stark von der Analysezeit für die 2D-Trennung bestimmt, und die theoretischen Überlegungen hinter dieser Auswahl sind einfach anzuwenden [27]. Trennungen in der zweiten Dimension, die lang dauern und eine hohe Auflösung erfordern, profitieren von langen Säulen (> 100 mm). Andererseits werden kurze Trennungen oder in Fällen, in denen nur eine grobe 2D-Trennung erforderlich ist (z. B. bei Entsalzungsanwendungen), kurze Säulen (< 100 mm) ausreichen. Bei Verwendung der UV-Detektion in der zweiten Dimension sind Säulen mit größerem Durchmesser (> 3, 0 mm i. d.) und höheren Durchflussraten (> 1ml/min) wünschenswert, da diese Bedingungen die Auswirkungen des großen Volumens des injizierten 1D-Eluats mildern. Andererseits sind bei der MS-Detektion in der zweiten Dimension Säulen mit kleinerem Durchmesser (< 2,1 mm i. d.) und niedrigeren Flussraten (< 1ml/min) wünschenswert, um das „Fluten“ des MS-Einlasses mit Lösungsmittel zu vermeiden.
1.4.2 Bei null anfangen – flexible Bedingungen in der ersten Dimension
Wenn wir eine 2D-LC-Methode von Grund auf neu entwickeln, haben wir nicht so viele Einschränkungen zu beachten wie beim Hinzufügen einer 2D-Trennung zu einer bestehenden 1D-LC-Trennung. In den meisten Fällen nutzen die Anwender diese Freiheit, indem sie die Durchflussrate der 1D-Trennung reduzieren, sodass das Volumen des 1D-Eluats, welches in die 2D-Säule geleitet wird, nicht so groß ist wie im oben beschriebenen Szenario. Dies ist besonders hilfreich bei LC × LC-Trennungen, bei denen 2D-Säulen tendenziell klein sind, um schnelle 2D-Trennungen zu ermöglichen. In diesem Fall beträgt eine typische 1D-Durchflussrate 50 μl/min. Aber selbst bei LC-LC- und hybriden 2D-LC-Trennungen ist der Umgang mit einer 1D-Flussrate von 200 μl/min wesentlich einfacher als der Umgang mit 1000 μl/min.
1.4.3 Besonderheiten bei umfassenden 2D-LC-Methoden
Wie in Abb. 1.2 dargestellt, werden bei umfassenden 2D-LC-Trennungen viele Fraktionen des 1D-Eluats gesammelt und im Verlauf einer einzigen 2D-LC-Analyse in die 2D-Säule überführt. Dies bedeutet, dass alle mit einer einzigen 2D-Trennung verbundenen Schritte im Verlauf einer LC × LC-Analyse zehn- oder hundertmal stattfinden, einschließlich eines oder zweier Ventilschaltungen je Fraktion, in der Regel einhergehend mit einer veränderten Zusammensetzung der mobilen Phase für die Elution der injizierten Komponenten. Die meisten LC × LC-Trennungen dauern zwischen 30 min bis 3 h, wobei die Zeitskala jeder 2D-Trennung normalerweise 15–120 s beträgt. Dies wiederum erfordert, dass die zweite Dimension mit kurzen (< 50 mm), schmalen (2,1 mm i. d.) Säulen und hohen (> l ml/min) Flussraten betriebenwird. Natürlich gibt es Ausnahmen, aber diese Bedingungen sind typisch. In unserer Arbeit haben wir beobachtet, dass die Konstruktion des Ventils, das für den Transfer von 1D-Eluatfraktionen in die zweite Dimension verwendet wird, und der Druck, bei dem die 2D-Säule betrieben wird, einen signifikanten Einfluss auf die Lebensdauer von 2D-Säulen haben, weshalb diese Parameter bei der Entwicklung von LC × LC-Methoden unbedingt in Betracht gezogen werden sollten [23, 28].
1.4.4 Faustregeln
1 1. Wenn Sie RP-Trennungen in beiden Dimensionen verwenden, versuchen Sie, die Säule mit der geringeren Retention für die erste Trennung zu verwenden. Dies trägt dazu bei, den Volumeneffekt bei der Übertragung des 1D-Eluats auf die 2D-Säule in Grenzen zu halten.
2 2. Schätzen Sie die Stärke des Lösungsmittels im 1D-Eluats im Vergleich zum Startpunkt bei der 2D-Trennung. Stellen Sie bei RP-Trennungen sicher, dass das 1D-Eluat etwa 10 % weniger organisches Lösungsmittel enthält; dies führt in der Regel zu guten Ergebnissen. Wenn dies nicht möglich ist, kann der Anteil an organischem Lösungsmittel mithilfe aktiver Modulation angepasst werden [25].
3 3. Ein guter Ausgangspunkt ist die Verwendung von Säulen mit gleichem Durchmesser für die 1D- und 2D-Trennung.
1.5 Beispiele für die Methodenentwicklung
Im Rahmen dieses Beitrags ist es nicht möglich, alle Aspekte der Methodenentwicklung im Detail zu behandeln. Ich denke, die nächstbeste Möglichkeit ist es, einige Beispiele von 2D-LC-Methoden vorzustellen und die wichtigsten Entscheidungen bei deren Methodenentwicklung zu erklären. Dies soll den Lesern ermöglichen, eine ähnliche Vorgehensweise bei der Entwicklung ihrer eigenen Methoden anzuwenden.
1.5.1 Beispiel Nr. 1 – Verwendung von LC-LC zur Identifizierung einer Verunreinigung in einem synthetischen Oligonukleotid
Dieses erste Anwendungsbeispiel, das aus der Arbeit von Koshel et al. stammt, verwendet eine einzelne 2D-LC-Heartcut-Methode zur Identifizierung einer Verunreinigung in einem synthetischen Oligonukleotid mittels Massenspektrometrie [29]. In der Vergangenheit war die Identifizierung solcher Verunreinigungen durch MS schwierig, da die hohen Konzentrationen langkettiger aminhaltiger Ionenpaar-Reagenzien, die für RP-Trennungen von Oligonukleotiden verwendet werden, mit der MS-Detektion nicht gut kompatibel sind. Die in Abb. 1.5a gezeigte 2D-LC-Methode ermöglicht jedoch die Trennung der Verunreinigung vom Zieloligonukleotid durch die 1D-Säule und die anschließende Trennung der Verunreinigung von langkettigen Ionenpaar-Reagenzien durch die 2D-Säule vor der Detektion. In diesem Fall wird in beiden Dimensionen die gleiche RP-Säulenchemie verwendet. Obwohl dies bei 2D-LC-Trennungen im Allgemeinen ungewöhnlich ist, ist es hier wirksam, weil die in der ersten und zweiten Dimension verwendeten Ionenpaar-Reagenzien chemisch recht unterschiedlich sind (Hexylamin vs. Triethylamin + Hexafluorisopropanol) und zu unterschiedlichen Selektivitäten führen. Die wichtigen Parameter für die Trennung sind in Tab. 1.1 dargestellt. Die 1D- und 2D-Fließgeschwindigkeiten
