Analytik des Moleküls bei einem pH-Wert 3 auf die RPLC zurückgreifen, bei höheren pH-Werten ist HILIC empfehlenswert. Es ist also auch naheliegend, dass der pH-Wert für den entsprechenden Ladungszustand der Moleküle stabil gehalten werden muss oder wie – in dem Buchkapitel zur „Gradientenelution in HILIC“ beschrieben [5] – bewusst zur Ladungsänderung von Molekülen in pH-Gradienten genutzt werden kann.
In dem hier vorliegenden Buchkapitel beschreibe ich den derzeitigen Stand des Wissens um den Trennmechanismus von Molekülen unter Berücksichtigung der Wasserschicht auf der Partikeloberfläche (und somit dem Verteilungsgleichgewicht der Moleküle zwischen mobiler Phase und der wässrigen Phase an der Oberfläche) und den Adsorptionseigenschaften der stationären Phase sowie den eventuell vorhandenen elektrostatischen Wechselwirkungsstellen der stationären Phase nicht. Anstatt dessen sei an dieser Stelle hierzu auf eigene frühere Arbeiten [2, 6] oder aber auch auf die exzellenten Arbeiten von Kolleg:innen [7–9] verwiesen. Auch wenn hier darauf verzichtet wird, die Kenntnis der mechanistischen Grundlagen ist wesentlich, um eine Methodenentwicklung systematisch durchführen zu können. Nehmen Sie sich also die Zeit, sich dieses Wissen anzueignen.
Abb. 2.2 Toluol und 4-Hydroxybenzoesäure als prominentes Beispiel [2] zum Vergleich in der Trennung mittels RPLC und mittels HILIC.
Kommt HILIC nun aufgrund der passenden Polarität der zu trennenden Substanzen als Trenntechnik in die engere Auswahl, fällt die Entscheidung letztlich darauf, diese zu nutzen – und haben Sie sich (in der weiterführenden Literatur) mit dem Trennmechanismus vertraut gemacht? Falls ja, dann steht einer erfolgreichen Umsetzung nichts mehr im Wege.
In diesem Kapitel liegt der Schwerpunkt gleichzeitig auf massenspektrometrischer Kompatibilität der HILIC-Bedingungen, was eine Methodenoptimierung letztlich aber auch ein bisschen vereinfacht (da einige Parameter durch die massenspektrometrische Detektion vorgegeben sind; siehe Abschn. 2.3).
Um eine erfolgreiche Optimierung sicherzustellen, sollte die Durchführung der Schritte bzw. Parameter immer in der folgenden Reihenfolge durchgeführt werden:
1 I. Stationäre Phase
2 II. Mobile Phase mita) Organischem Laufmittelb) Salzenc) pH-Wert
3 III. Weitere Einstellungen bzw. Bedingungen speziell für massenspektrometrische Detektion
2.1 Ausgangssituation und optimale Nutzung von stationären HILIC-Phasen
Die Vielfalt der auf dem Markt befindlichen stationären HILIC-Phasen nimmt seit Jahren stetig zu, sodass es mittlerweile eine große Auswahl an (auch speziell für die HILIC entwickelte) Materialien gibt. Allerdings ist es für den Anwender ohne weitere Kenntnis der Eigenschaften seiner zu trennenden Substanzen (siehe dazu noch mal den vorherigen einführenden Abschnitt von Kapitel 2) nicht einfach, die passende Auswahl für die jeweilige Phase zu treffen. Letzten Endes entscheiden die Eigenschaften der Analyten nämlich darüber, ob man geladene oder nicht geladene stationäre Phasen nutzen sollte. Bevor wir uns allerdings mit den funktionellen Oberflächen der HILIC-Säulen im Detail beschäftigen, zuerst noch eine grundsätzliche Definition von HILIC-stationären Phasen. So besagt zum Beispiel unsere Definition von stationären HILIC-Phasen, dass typische HILIC-Phasen mit ihrem „hydrophilen Charakter Wasser auf der Oberfläche anreichern können sollten“ [2]. Zunächst einmal sind hierfür nicht alle Phasen gleichermaßen gut geeignet. Dabei beeinflusst zuallererst u. a. die unterschiedliche Hydrophilie der Materialien die Stärke der Wasserschicht, in die die Analyten aus der mobilen Phase durch sogenannte Verteilung übergehen können. Das hat selbstverständlich einen direkten Einfluss auf die Retention dieser Analyten. So ermöglicht die Anwesenheit geladener und/oder polarer funktioneller Gruppen auf der Materialoberfläche eine weitere Stabilisierung der Wasserschicht am Partikel. Auf der anderen Seite haben diese funktionellen Gruppen auch direkte Interaktionen mit entsprechenden Analyten, wie elektrostatische Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrückenbindungen. Somit ist es von großer Wichtigkeit, die stationäre Phase auf Basis der chemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Analyten zu wählen.
HILIC-Phasen basieren meist auf klassischen Silikapartikeln, neuerdings auch mit Polymeroberflächen. Dabei können bei Ersteren prinzipiell zwei Gruppen unterschieden werden (die im Folgenden behandelt werden): Silikapartikel mit daran chemisch gebundenen polaren funktionellen Gruppen und Silikapartikel mit unverändert freiliegenden Silanolgruppen. Ein prinzipielles Schema dieser Klassifizierung ist der Abb. 2.3 zu entnehmen.
Die ersten Anwendungen wurden ursprünglich überwiegend mit unmodifiziert vorliegenden freien Silikapartikel durchgeführt. Relativ früh wurde aber auch schon mit semipolaren Phasen gearbeitet, bekannt aus der RPLC, wie z. B. Cyano, Diol oder Amid (Tab. 2.1). Die freie Silikaphase ist auch heute noch eine der populärsten Materialien, reagiert aber leider sehr empfindlich auf kleine Änderungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase. Diese Silikaphasen haben freie Silanolgruppen auf der Oberfläche, die bei einem pH-Wert unter pH-Wert 4–5 neutral vorliegen, und ermöglichen polare Wechselwirkungen wie Dipol-Dipol und Wasserstoffbrückenbindungen mit den Analyten. Wird diese Phase bei einem pH über 4–5 betrieben, so liegt diese deprotoniert vor und kann dann zusätzlich auch als Kationenaustauscher fungieren, sodass positiv geladene basische Analyten stark zurückgehalten werden.
Abb. 2.3 Einordnung der stationären HILIC-Phasen (analog wie zu [2]).
Tab. 2.1 Einteilung der funktionellen HILIC-Phasen und Wechselwirkungsmöglichkeiten mit entsprechenden Analyten.
| Material und Bedingungen | Elektrostatische Wechselwirkung (WW) | Dipol-Dipol | Wasserstoffbrückenbindung |
|---|---|---|---|
| Silika, pH < 4,5 | Nein | Ja | Donor + Akzeptor |
| Silika, pH > 4,5 | Anionisch → WW mit Kation | Ja | Akzeptor |
| Cyano | Nein | Ja | Akzeptor |
| Diol | Nein | Ja | Donor + Akzeptor |
| Amid | Kationisch → WW mit Anion | Ja | Donor |
| Sulfobetain | Zwitterionisch → schwach kationisch und anionisch | Ja | Akzeptor |
| Phosphorylcholin | Zwitterionisch → schwach kationisch und anionisch | Ja | Akzeptor |
Fast alle Säulenhersteller haben neben ursprünglichem Silikamaterial oben erwähnte semipolare Phasen aus dem ursprünglichen RPLC-Bestand oder aber auch neue speziell entwickelte HILIC-Phasen im Produktangebot. Einen grundsätzlichen Überblick mit detaillierter Einschätzung der
