Analyten eingestellt werden. Im Gegensatz zu der RPLC, sollte der pH-Wert der mobilen Phase in HILIC bewusst so gewählt werden, dass die Analyten in ihre ionische Form übergehen. Da geladene Spezies generell polarer sind als die neutralen Spezies können diese bei der Trennung mit HILIC besser bzw. länger zurückgehalten, d. h. retardiert werden. Gleichzeitig sind geladene Spezies gut massenspektrometrisch detektierbar.
Wichtig (auch mit Blick auf den pH-Effekt der Silikaphasen) bleibt hier festzuhalten, dass der pH-Wert im Laufmittel grundsätzlich sehr stabil bzw. reproduzierbar gehalten wird, um so die Eigenschaften während eines Laufes nicht oder aber sehr reproduzierbar zu ändern.
2.3 Weitere Einstellungen bzw. Bedingungen speziell für massenspektrometrische Detektion (siehe auch Kap. 3)
Aufgrund der hohen Acetonitril-Gehalte zu Beginn von HILIC-Trennungen (und auch im Verlauf der Trennung) liegt es nahe, dass der Detektor „Massenspektrometrie“ sehr gut eingesetzt werden kann. Dies resultiert aus der Tatsache, dass aufgrund niedriger Oberflächenspannung der aus der HILIC-produzierten Spraytröpfchen bei der Ionisation, die Tröpfchen in der Quelle effektiv getrocknet werden und die Moleküle effizient in die Gasphase und somit – falls geladen – effizient in das Massenspektrometer transportiert werden können.
Beispiele zur vielseitigen HILIC-Nutzung mit massenspektrometrischer Detektion gibt es mittlerweile in großer Anzahl und das auch für sehr anspruchsvolle polare Moleküle und neuerdings oft auch mit quantifizierender Sichtweise. Eine Auswahl ist im Folgenden zitiert und lässt sich mittlerweile beliebig erweitern. So gibt es HILIC-Arbeiten zu Trennungen von Aminosäuren [12] und Metaboliten in biologischen Systemen [13] sowie Urin [14], Antibiotika [15] Lipide quantitativ in Blutplasma [16], Verunreinigungen von Pharmawirkstoffen [17] Umweltchemikalien [18,19], Flavonoide in pflanzlichen Extrakten [20], wie auch n-verbundene intakte Glykopeptide [21], Proteine [22] sowie intakte Proteine [23].
Aber man sollte auch die grundsätzlichen Probleme in der Nutzung von HILIC als sogenanntes „Front-End“-System für Massenspektrometer nicht verschweigen oder vernachlässigen. Denn aufgrund sogenannten Säulenblutens kann die oftmals empfindlichen Detektions- bzw. Nachweisgrenzen von Massenspektrometern stark beeinflusst und gestört sein. Hierzu sei eine ausführliche Studie mit 17 unterschiedlichen Säulen (und ihrem Einfluss auf 55 Komponenten) sehr empfohlen [24]. Diese Studie empfiehlt konsequente Methodenoptimierung und Bestimmung der Signalunterdückungseffekte für alle zu analysierenden Substanzen. Ebenso ist es essenziell, Matrixeffekte von koeluierenden Substanzen zu erfassen [18, 25].
Eine weitere Publikation sei auch erwähnt und zum Studium empfohlen, wenn es um die Effekte von Detektion und Peakformen bei HILIC-MS geht [26]. Dort wird einprägsam aufgezeigt, dass auch nur kleine Unterschiede bzw. Schwankungen in den Zusammensetzungen von mobiler Phase und der Injektionslösungsmittel große Auswirkungen haben können. Diese Arbeit zeigt noch mal eindrucksvoll die in diesem Kapitel erwähnte Notwendigkeit zur akkuraten Arbeit in der Herstellung von mobiler Phase und Injektionssolvent auf.
Solche Studien zeigen auch schon Erfolg, denn in jüngerer Zeit wird an Lösungen für die HILIC-Probleme aktiv gearbeitet. Neuentwicklungen wie die sogenannte FEED-Injektion (genauer die „Focused, Extended, Extra-control, Delay-volume free“-Injektion; Agilent persönliche Mitteilung) werden zukünftig helfen können, wässrige Injektionen effektiv druchzuführen. In diesem neuen Konzept findet nach der Injektion einer Probe die Durchmischung des Injektionsflusses über ein „T-Stück“ mit der mobilen Phase statt. Somit bringt man die Analyten nicht als ungemischte Probe – schlimmstenfalls im „falschen“ Lösungsmittel – direkt auf die Säule, sondern verdünnt immer in mobiler Phase. Die fehlende Durchmischung vieler Injektionssysteme führt bisher zu oben erwähnter schlechter bzw. Nichtinjizier- barkeit von wässrigen Proben auf eine HILIC-Phase. An dieser Stelle sei nun abschließend empfohlen, die injizierten wässrigen Proben in nur geringem Volumen zu injizieren oder vor Auftreffen auf die Säule mit mobiler Phase (z. B. mittels FEED Injektor) zu durchmischen oder aber in einer seriellen RPLC-HILIC-Kopplung auf die RPLC-Säule aufzugeben [18].
Kurze Zusammenfassung zur Methodenoptimierung in HILIC
Ermöglichen die zu analysierenden Moleküle aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften eine Trennung mittels HILIC, so sollte man die stationäre Phase mit Sorgfalt auswählen und dann im Anschluss die mobile Phase schrittweise optimieren. Die elektrostatischen Wechselwirkungsmöglichkeiten einiger stationärer Phasen lassen die Trennung zunächst komplizierter erscheinen, aber auch dieses kann man in Hinblick auf die zu trennenden Substanzen sehr gut einschätzen und nutzen.
Es gilt an diesem Punkt noch mal zu erwähnen, dass die Zusammensetzung der mobilen Phase insgesamt einen größeren Einfluss auf die Retentionszeit hat als die anderen Parameter. Also auch abschließend bleibt die Reihenfolge für die HILIC- Methodenoptimierung (in Kombination mit massenspektrometrischer Detektion) folgendermaßen erhalten:
1 I. Stationäre Phase
2 II. Mobile Phase mita) Organischem Laufmittelb) Salzenc) pH-Wert
3 III. Weitere Einstellungen bzw. Bedingungen speziell für massenspektrometrische Detektion
Literatur
1 Alpert, A.J. (1990). Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides nucleic acids, other polar compounds. J. Chromatogr. 499: 177–196.
2 Bieber, S., Döteberg, H.-G., Greco, G., Kromidas, S. und Letzel, T. (2016). HPLC-Tipps Band 3: Gradient, HILIC, SFC und Trends in der HPLC, (Hrsg. S. Kromidas), Pirrot-Verlag, ISBN 9783-937436-58-6.
3 ChemAxon (2020) log D predictor; https://disco.chemaxon.com/calculators/demo/plugins/logdzuletzt20.05.2020.
4 PubChem (2020) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/135#section=Decomposition zuletzt 20.05.2020.
5 Letzel, T. (2019). Spezifika der Gradientenelution in der HILIC, In: Der Gradient in der HPLC für Anwender: RP, LC-MS, Ionenanalytik, Biochromatographie, SFC, HILIC. (Hrsg. S. Kro- midas), 1. Auflage, S. 197–203. Wiley-VCH; ISBN-10: 3527344047.
6 Greco, G. und Letzel, T. (2013). Main interactions and influences of the chromatographic parameters in HILIC separations. J. Chromatogr. Sci. 51 (7): 684–693.
7 Buszewski, B. und Noga, S. (2012). Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) – A powerful separation technique. Anal. Bioanal. Chem. 402 (1): 231–247.
8 Nováková, L., Havltková, L. und Vlčko-vá, H. (2014). Hydrophilic interaction chromatography of polar and ionizable compounds by UHPLC. TrAC Trends Anal. Chem. 63: 55–64.
9 Guo, Y. (2015). Recent progress in the fundamental understanding of hydrophilic interaction chromatography (HILIC). Analyst 140 (19): 6452–6466.
10 Alpert, A.J. (2018). Effect of salts on retention in hydrophilic interaction chromatography. J. Chromatogr. A 1538: 45–53.
11 Jandera, P. (2011). Stationary and mobile phases in hydrophilic interaction chromatography: A review. Anal. Chim. Acta 692: 1–25.
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