Phasen mit polaren funktionellen Gruppen werden durch Derivatisierung der entsprechenden Silanolgruppen an der Oberfläche hergestellt. Diese können dann konventionell je nach Basis des Ladungszustands der funktionellen Gruppen in neutrale, geladene oder zwitterionische Phasen eingeteilt werden (Abb. 2.3).
Neutrale stationäre Phasen enthalten polare funktionelle Gruppen, die im typischen HILIC-Bereich in ihrer Neutralform vorliegen. Somit basiert die Retention der Analyten hierbei überwiegend auf der oben erwähnten Anreicherung in der wässrigen Oberfläche und der hydrophilen Wechselwirkung mit den funktionellen Gruppen. Viele der stationären HILIC-Phasen gehören in diese Kategorie.
Die positiv geladene Aminophase ist auch eine in der HILIC oft genutzte stationäre Phase. Die funktionelle Gruppe besteht meistens aus einem Aminopropylrest mit einer primären Aminogruppe (und dem sogenannten Kohlenwasserstofflinker, „Spacer“), welche positiv geladen vorliegt, und hohe Affinität für anionische sowie saure Analyten zeigt. Aufgrund der resultierenden elektrostatischen Wechselwirkung werden diese Anionen stark an die Phase gebunden und über den Anionenaustauschmechanismus getrennt. Aminophasen können allerdings auch sehr erfolgreich für die Trennung neutraler polarer Moleküle genutzt werden, die aufgrund der hohen Hydrophilie dieser Phasen stark auf der Säule zurückgehalten werden.
Zwitterionische stationäre HILIC-Phasen sind schon in verschiedenen Versionen erhältlich und können als universellste aller HILIC-Phasen eingesetzt werden. Zwitterionische Reste enthalten sowohl eine permanente positive als auch eine permanente negative Ladung. Diese Phasen sind sehr hydrophil, beinhalten gleichzeitig moderate Ionenaustauscher-Eigenschaften. Aus diesem Grund können diese Phasen sowohl für die Trennung von neutralen, sauren als auch basischen organischen Molekülen herangezogen werden wie auch für anorganische Ionen.
Eine gute Regel um die am besten geeignete HILIC-Phase auszuwählen, ist es zu berücksichtigen, dass neutrale Analyten in der Regel weniger hydrophil sind als die geladenen. Somit sind für die neutralen Moleküle neutrale, geladene bzw. zwitterionische Phasen entsprechend gut für die Retention des Analyten geeignet. Auf der anderen Seite sind geladene Moleküle durch deren elektrostatische Anziehungskräfte mit der entgegengesetzten geladenen Phase von HILIC-Materialien oft so stark retardiert, dass auch hier neutrale und zwitterionische Phasen oftmals das beste Ergebnis bringen.
Und es ist hier erwähnenswert, dass man in der massenspektrometrischen Detektion ja eben auch Ionen erfasst, was somit sehr kompatibel ist mit den in der HILIC-ionisch vorliegenden Analyten.
Nach der Wahl der richtigen stationären Phase steht nun die Auswahl und Optimierung der mobilen Phase an.
2.2 Ausgangssituation und optimale Nutzung von mobiler HILIC-Phase
Wesentliche Charakteristika bei der Trennung mittels HILIC sind je nach gewählter stationärer Phase die Eigenschaften der Verteilung, der Adsorption und eventuell der elektrostatischen Wechselwirkung. Eine Gemeinsamkeit sämtlicher stationärer Phasen ist wie oben beschrieben die Fähigkeit, durch Wasseradsorption auf der Oberfläche der Partikel eine Wasserschicht ausbilden zu können. Hydrophile Komponenten werden vor allem deshalb auf den HILIC-Phasen zurückgehalten, weil sich diese bevorzugt in der ausgebildeten Wasserschicht anreichern können, wobei hydrophobere Komponenten dies nicht bzw. weniger gut tun und deshalb früh(er) eluieren.
Es ist nun wichtig zu wissen, welchen Einfluss die folgenden drei Bedingungen auf die Eigenschaften der mobilen Phase haben, die ja verantwortlich ist für den Transport der Moleküle. Diese Eigenschaften beeinflussen einerseits die Löslichkeit (bzw. die Verteilung) der Analyten in der mobilen Phase (bzw. in Kontakt mit der Wasserschicht), haben aber auch direkt Auswirkung auf die Wasserschicht auf der Partikeloberfläche selbst. Im Folgenden werden die drei Parameter (a) organisches Lösungsmittel, (b) Salz und (c) der pH-Wert einzeln erörtert.
a) Organisches Laufmittel
Auf dieser Grundlage heißt es also, dass der erste (aber auch wichtigste) Parameter zur Methodenentwicklung die Art und der Gehalt an organischem Lösungsmittel in der mobilen Phase ist.
Die Art des Lösungsmittels in der HILIC ist meistens schnell gefunden (besonders, wenn man die massenspektrometrische Detektion nutzt). Die Polarität und damit die Elutionskraft der mobilen Phase kann durch die Nutzung unterschiedlicher organischer Lösungsmittel gesteuert werden. Verschiedene wassermischbare Lösungsmittel, die man verwenden kann, enthalten Alkohole oder sind zyklische Ether. Prinzipiell ist bei HILIC-Trennungen folgende abnehmende Elutionskraft von Laufmittel in der mobilen Phase festzustellen: Methanol > Ethanol > Isopropanol > Tetrahydrofuran > Acetonitril. Je stärker die Elutionskraft ist, umso schwieriger ist das Laufmittel aber zu dosieren und aufgrund der protischen Eigenschaften (der Alkohole) für die Ausbildung der Wasserschicht schlechter geeignet. Bis auf Methanol sind die Laufmittel in der Massenspektrometrie auch nur eingeschränkt bis nicht nutzbar. Somit ist Acetonitril aufgrund schwacher Elutionskraft sowie nicht protischer Eigenschaften und massenspektrometrischer Kompatibilität das meistgenutzte Lösungsmittel für HILIC-Trennungen und repräsentiert die beste Wahl für einen ersten Einstieg in die Methodenoptimierung. Also steht das organische Laufmittel schon mal fest: Acetonitril.
Das Laufmittel mit starker Elutionskraft ist (aufgrund der Notwendigkeit einer Wasserschicht auf der HILIC-Oberfläche) auch schon klar: Wasser.
Für Trennungen in HILIC (wie bei RPLC auch) gibt es nun die Möglichkeit, die mobile Phase isokratisch oder aber in einem Gradienten zu pumpen. In der Methodenoptimierung ist es meistens zweckdienlich, sich eines Lösungsmittelgradienten zu bedienen; zum einen um die Laufmittelzusammensetzung zur optimalen Elution der interessierenden Moleküle zu ermitteln und zum anderen um die Peak-Schärfung bzw. die -Forcierung zu unterstützen. So ist es essenziell, dass man zunächst die Verteilung der Analyten zwischen der mobilen Phase und der an der Oberfläche der stationären Phase befindlichen Wasserschicht berücksichtigt. In HILIC starten die Bedingungen des Gradienten bei einem sehr hohen Anteil an schwachem Elutionsmittel, d. h. typischerweise 95 % Acetonitril (maximaler Anfangsgehalt 98 % bzw. minimal 90 %). Ein Beispiel hierfür ist in Abb. 2.4 zu sehen. Die anschließende Elution retardierter Moleküle wird durch Erhöhung des starken Elutionsmittels Wasser auf typischerweise bis zu 40 % realisiert. Bei diesem Wassergehalt im Laufmittel kann die Wasserschicht auf der Partikeloberfläche nicht mehr aufrechterhalten werden und die meisten neutralen, polaren Analyten eluieren dann umgehend. In dieser Situation hat dann der Parameter „Verteilung zwischen Wasserschicht und mobiler Phase“ keinen Einfluss mehr auf die Retention der Moleküle. Auf der Oberfläche der stationären Phase vorhandene funktionelle Gruppen können dann lediglich noch adsorptive und bei geladenen Säulen auch elektrostatische Wechselwirkungen mit den Analyten ausbilden. Die Konsequenz ist zu diesem Zeitpunkt eine Co-Elution vieler polarer Moleküle und somit dort eine häufig schlechte chromatographische Trennung. Dies gilt es immer dann zu bedenken, wenn man sehr schnelle und steile Lösungsmittelgradienten nutzen möchte. In der RPLC-Anwendung funktioniert das häufig gut, in der HILIC aus oben genannten Gründen eher nicht. Zu flach sollte der Gradient aber aufgrund der ungünstigen Bedingungen (der van-Deemter-Gleichung) auch nicht sein, denn dann werden die Peaks breit (ko)eluierend und verlieren ihre Form. Ein generischer Elutionsgradient ist in Abb. 2.4 dargestellt und kann – bestehend aus einer Wasser-/Acetonitril-Mischung – als ein erster Schritt in der detaillierter werdenden Methodenentwicklung genutzt werden. So bekommt man auf jeden Fall einen ersten Eindruck über die Elutionseigenschaften der jeweils zu trennenden Substanzen und deren polaren Eigenschaften.
HILIC reagiert – wie bereits erwähnt – im Betrieb sehr viel empfindlicher gegenüber Laufmitteländerungen als die RPLC. Aus diesem Grund sind hier die noch weitere Informationen bzw. Vorsichtsmaßnahmen beschrieben, die Ihnen bei der Methodenoptimierung weiterhelfen können, und die Sie auch berücksichtigen sollten: So ist das Lösungsmittel der zu injizierenden Probe immer kritisch. Da hohe lokale wässrige Anteile wie in einer Wasserprobe
