Halten Sie den Gehalt an Acetonitril je nach Analyt so hoch wie möglich. Methanol bis zu 20 % kann die Löslichkeit des Analyten unterstützen. Auf jeden Fall sollte der Wassergehalt in der zu injizierenden Probe unter 5 % gehalten werden oder aber die Wasserprobe langsam einbringen. So ermöglichen es langsame Injektionen von geringen Volumina beispielsweise wässrigen Proben über eine Vermischung mit der mobilen Phase vor Auftreffen auf die stationäre Phase geeigneten Bedingungen zuzuführen und somit keine Veränderung der Säulenoberfläche hervorzurufen. Weitere Möglichkeiten, Wasser zu injizieren, finden Sie am Ende des Kapitels. Ebenso sind Waschlösungen der Injektionsnadel kritisch. Verwenden Sie immer Acetonitril mit 5–10 % Wasser ohne Zusatz von Säuren oder Salzen, denn alles andere kann die Zusammensetzung des Laufmittels bei der Injektion kurzfristig ein klein wenig verändern und das führt oftmals schon zu unreproduzierbaren Änderungen in der Retentionszeit. Ebenso sind vorgemischte Lösungsmittel eine problematische Sache, v. a. dann, wenn unterschiedliche Anwender Laufmittel unterschiedlich herstellen. Die Retention bei HILIC verändert sich teilweise schon sehr drastisch auch bei kleinen Änderungen des Wasser- (und Salz-)Gehaltes. So ist es notwendig, dass es sehr detaillierte Handlungsanweisungen im Labor gibt, die genau wiedergeben, wie das Laufmittel hergestellt wird bzw. werden soll. Die Nutzung von industriell vorgemischten bzw. immer im gleichen Verfahren hergestellten Acetonitril/Wasser- lösungen hilft die Reproduzierbarkeit der Analysen zu erhöhen.
Abb. 2.4 Typischer HILIC-Gradient mit Verlauf und Zusammensetzung der mobilen Phase (oben) und dem entsprechenden Wechselwirkungsschema eines Analyten mit der Oberfläche der stationären Phase (entnommen aus [5]).
Nutzen Sie wie in Abb. 2.4 angegeben nach einem Gradienten eine erhöhte Flussrate bei der Rekonditionierung Ihrer Säule, ohne den Maximaldruck der Pumpe zu überschreiten. So können Sie den vermeintlichen Nachteil von Lösungsmittelgradienten in der HILIC durch die bekannte „lange“ Rekonditionierungszeit der stationären Phase vermeiden. Für eine ausreichende Rekonditionierung werden im Gegensatz zu RPLC nämlich statt zehn etwa zwanzig bis dreißig Säulenvolumina benötigt. Durch die Erhöhung der Flussrate kann man die Säule somit ausreichend schnell rekonditionieren. Alternativ ist es möglich, eine kürzere Zeit bei konstanter Flussrate zu äquilibrieren. Dies führt zu einem sogenannten „dynamischen Gleichgewicht“ und kann ebenfalls zu reproduzierbaren Ergebnissen führen. Hierbei muss aufgrund der unvollständigen Äquilibrierung sichergestellt sein, dass die Äqulibrie- rungszeit und die Flussrate zwischen den Läufen immer identisch bleiben. Davon ist vor allem vor dem Hintergrund, dass schon kleine Änderungen in der HILIC- Trennung große Effekte haben können, eher abzuraten (v. a. dann, wenn man nicht schon längere Erfahrung mit dieser Technik hat). Apropos kleine Änderungen und große Effekte, Abb. 2.5 zeigt die zwei Moleküle 2-Hydroxy- und 4-Hydroxybenzoe- säure (Molekül 1 bzw. 2) in ihrer Retention und Performance auf drei stationären Phasen in einem isokratischen Lauf bei 90 % Acetonitril (obere Chromatogramme) und bei 80 % Acetonitril (untere Chromatogramme). Wie v. a. an der 4-Hydoxybenzoesäure gut zu erkennen ist, reduziert sich die Retentionszeit auf allen drei Phasen sehr stark, wobei offensichtlich nur die kationisch geladene Oberfläche bei 80 % Acetonitril noch ausreichend Retention aufweist.
Abb. 2.5 Trennung von 2-Hydroxy- und 4-Hydroxybenzoesäure (Molekül 1 bzw. 2) in Chromatogrammen mit Retention und Performance auf drei stationären Phasen gezeigt. Die Untersuchungen erfolgten in einem isokratischen Lauf bei 90 % Acetonitril (obere Chromatogramme) und bei 80% Acetonitril (untere Chromatogramme). Diese Abbildung wurde verändert und genutzt aus ursprünglich [6].
b) Salze
Salze werden der mobilen Phase typischerweise zugesetzt, um die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen geladenen Analyten und der stationären Phase kontrollieren zu können. Normalerweise führt dies dadurch auch zur Verbesserung der Peakform der eluierenden Analyten durch geringeres Peak-Tailing. Normalerweise werden zur Nutzung von massenspektrometrischer Detektion in der HILIC ausschließlich Salze wie Ammonium-Acetat und Ammonium-Formiat eingesetzt, manchmal auch Ammonium-Bikarbonat. Diese Salze lösen sich sehr gut in Laufmittel mit hohen Acetonitril-Gehalten und sind gleichzeitig flüchtig genug, um im Ionisationsprozess des Massenspektrometers entfernt werden zu können. Die Nutzung von weniger gut löslichen Salzen, wie Phosphaten oder Ionenpaarreagenzien, wie TFA, sollten nach Möglichkeit vermieden werden.
Abb. 2.6 Trennung von 2-Hydroxy- und 4-Hydroxybenzoesäure (Molekül 1 bzw. 2) in Chromatogrammen mit Retention und Performance auf drei stationären Phasen gezeigt. Die Untersuchungen erfolgten in einem isokratischen Lauf bei 10 mM Ammonium-Acetat im wässrigen Laufmittel (obere Chromatogramme) und 15 mM Ammonium-Acetat (untere Chromatogramme). Diese Abbildung wurde verändert und genutzt aus ursprünglich [6].
Die zwei Salze Ammonium-Acetat und Ammonium-Formiat sind nicht identisch einsetzbar, denn Ammonium-Formiat ergibt in der mobilen Phase einen stärker sauren pH-Wert als Ammonium-Acetat. Dies lässt allerdings die Nutzung einer Mischung aus beiden Salzen in der Trennung bei unterschiedlichen pH-Werten zu. Ammonium-Bikarbonat enthaltende Lösungen sind nicht zu empfehlen, denn diese sind sehr instabil. Durch Ausdampfen von Kohlenstoffdioxid verändert sich zum einen der Salzgehalt und zum anderen auch der pH-Wert (bis hin zum Basischen).
Im Gegensatz zur RPLC hat der Salzgehalt im HILIC-Laufmittel direkt einen großen Einfluss auf die Retentionszeit von Analyten (siehe hier auch die Chromatogramme in Abb. 2.6, bei denen zwischen oberen und unteren lediglich ein Unterschied von 5 mM Ammonium Acetat im Laufmittel vorliegt). Der prinzipielle Effekt der Erhöhung des Salzgehaltes in der mobilen Phase ist die Erniedrigung der elektrostatischen Wechselwirkungen im Falle von geladenen Molekülen mit geladenen oder zwitterionischen Säulenmaterialien (siehe auch [2]). Im Falle von elektrostati scher Anziehung zwischen Analyten und stationärer Phase führt dies zu einer verringerten Retention, wobei es im Falle von elektrostatischer Abstoßung zu erhöhter Retention des entsprechenden Analyten führt.
Der zweite Effekt einer Erhöhung des Salzgehaltes in der mobilen Phase zeigt sich in der Schichtdicke der Wasserschicht auf der Oberfläche von HILIC-Materialien. Der hohe Gehalt an organischem Lösungsmittel zwingt das Salz zur bevorzugten Anreicherung in der Wasserschicht. Eine zunehmende Salzkonzentration führt somit zu einer zunehmenden Schichtdicke der Wasserschicht, was einhergeht mit einer stärkeren Retention sämtlicher polarer Analyten. Aus diesem Grund bewirkt ein signifikant erhöhter Salzgehalt für polare nicht geladene Analyten auch ohne die elektrostatische Wechselwirkung eine erhöhte Retention.
Salze in der HILIC-Trennung haben auch noch weitergehende Eigenschaften. Ein jüngst durch A. Alpert beschriebener Effekt ist die sogenannte Aussalzung von Kationen bei sehr starker Erhöhung des kosmotropischen Salzgehaltes und überlagert die verlängerte Retention in der stärkeren Wasserschicht [10]. Laut den Beschreibungen zur Aussalzung von Alpert, aber auch von Jandera [11] können generell höhere Salzgehalte sowohl zu höheren Retentionszeiten wie auch zu niedrigeren Retentionszeiten führen, was die einfache Interpretation und Nutzung von Salzanwendung letztlich erschwert. Da diese Studien aber überwiegend mit nichtflüchtigen Salzen erfolgt sind, sei dieser Effekt hier nur erwähnt.
Wichtig bleibt jedoch festzuhalten, dass der Salzgehalt im Laufmittel grundsätzlich sehr stabil bzw. reproduzierbar gehalten werden sollte, um so die Eigenschaften der Wasserschicht bzw. der adsorptiven Wechselwirkungen während eines Laufes nicht oder aber sehr reproduzierbar zu ändern.
c) pH-Wert
Grundsätzlich
