Abb. 3.1 Peakkapazität in Abhängigkeit des Gradientvolumens, ausgedrückt als Vielfaches des Trennsäulenvolumens, gemessen für eine 250 × 2,1 mm-Säule mit einer Packungsteilchengröße von dp = 2,2 μm bei F = 670 μL/min.
Empfehlungen
• Hochauflösende Screening-Analysen können mit schnellen/steilen Gradienten und geringer Peakkapazität zu schnell für die Zykluszeit eines Massenspektrometers sein.
• Gegebenenfalls muss auf Trenneffizienz verzichtet und die Auflösung künstlich vergrößert werden, um eine adäquate MS-Detektion zu erlauben.
• Die durchschnittliche Cycle Time des Massenspektrometers unter den benötigten Detektionsbedingungen sollte für eine Quantifizierung mindestens 15, jedoch nicht weniger als 8–10 Datenpunkte pro Peak ermöglichen.
3.2.1.3 Laufmittel in der LC-MS-Analytik
Eine MS-kompatible mobile Phase erfordert, dass alle Bestandteile der mobilen Phase leichtflüchtig sind. Für die Solventien selbst ist dies in der RP-Chromatographie praktisch immer hinreichend erfüllt: Das Fließmittel mit der höchsten Verdampfungsenthalpie, Wasser, ist mit ESI- und APCI-Verfahren sehr gut kompatibel und oft sogar unverzichtbar für das Funktionieren der Ionisationsverfahren. Organische Lösemittel im Gegenzug fördern die Trocknung des Eluats im Sprayverfahren nicht nur durch ihren höheren Dampfdruck, sondern auch, indem sie die Oberflächen-Spannung der Flüssigkeitströpfchen während der Vernebelung herabsetzen und dadurch das Verdampfen der Lösemittelmoleküle begünstigen. Für eine vertiefte Betrachtung zu diesem Thema sei auf die Literatur [4] verwiesen.
Die leichte Flüchtigkeit muss genauso für alle Zusätze zur mobilen Phase gegeben sein. Sämtliche Additive, die schwerflüchtige Salze bilden, führen zu verstärkter Unterdrückung der Ionenbildung in der Quelle (Ionensuppression) und zu starker Verschmutzung der MS-Quelle mit Salzablagerungen. Dies erfordert eine häufige und intensive Reinigung der Ionenquelle und führt trotz diverser Konstruktionsverbesserungen durch die MS-Hersteller rasch zu einer spürbaren Abnahme in der Empfindlichkeit der Detektion. Zur pH-Einstellung und Pufferung sowie zur Verbesserung der Chromatographie sind daher HPLC-Klassiker wie Phosphate, Borate sowie alkali- und erdalkaliionenhaltige Salze zu vermeiden. Stattdessen bieten sich leichtflüchtige organische Säuren, Basen sowie deren Salze an. Saure pH-Werte werden bevorzugt mittels Ameisensäure, Essigsäure oder Trifluoressigsäure erzeugt, meist in Konzentrationen zwischen 0,05 und 0,1 vol.-%. Als Basen haben sich wässrige Ammoniaklösungen oder Alkylamine wie Triethylamin bewährt. Zur Pufferung empfehlen sich Ammoniumsalze wie Ammoniumformiat, -acetat oder -carbonat. Auch auf die Verwendung oxidativer Zusätze sollte verzichtet werden: Chloride als Eluentenzusatz führen z. B. nicht nur zu Ionensuppression, sie können auch unter dem Einfluss des Elektrosprays oxidativ wirkendes Chlor bilden und damit die Analyten chemisch verändern [5] sowie über die Zeit hinweg Bauteile wie die Spraykapillare korrodieren. Der Einsatz von leichtflüchtigen ionischen Detergenzien wird ebenfalls nicht empfohlen, da sich diese beim Eintreten in das Massenspektrometer auf den Oberflächen der Ionenoptik und des Massenanalysators ablagern und mittelfristig eine Funktionsstörung des Gerätes auslösen können. Es sei hier bereits angemerkt, dass die MS-gängigen Additive wegen ihrer physikochemischen Eigenschaften, die sich teilweise deutlich von den herkömmlichen LC-Modifiern unterscheiden, oft zu anderen Selektivitäten führen, als man sie von der klassischen HPLC her gewohnt sein mag (s. Abschn. 3.3.1). Dies gilt vor allem, wenn sie sekundäre selektivitätssteuernde Eigenschaften beeinflussen, wie beispielsweise die Ionenstärke oder die Tendenz zur Ionenpaarbildung bei polar retardierten Substanzen.
Neben der Art des Eluentenadditivs spielt auch dessen Konzentration eine Rolle. LC-Methoden profitieren meist von einer möglichst hohen Additivkonzentration, so z. B. bei Pufferkapazitäten oder der Unterdrückung von elektrostatischen Wechselwirkungen des Analyten mit der stationären Phase. Die damit einhergehende hohe Leitfähigkeit führt allerdings zu hohen Stromflüssen in der Ionenquelle während des Ionisationsprozesses und damit oft zu technischen Problemen oder einer Instabilität des Sprays. In der Praxis empfiehlt es sich, Additive nicht konzentrierter als 25–30 mmol/l hinzuzufügen und möglichst auf mehrfach geladene Additivionen zu verzichten.
Empfehlungen
• „MS-freundliches“ Phasensystem einsetzen und LC-Methode mit UV-Detektion optimieren
• Stationäre Phasen mit geringem Säulenbluten verwenden
• Flüchtige Eluentensysteme verwenden, meist zusammengesetzt aus flüchtigen organischen Säuren oder Basen in Wasser-Methanol oder Wasser-Acetonitril
• Schwerflüchtige Salzbildner, reaktive Eluentenzusätze und Detergenzien vermeiden
• Puffer-/Additivkonzentrationen von ≤ 30 mmol/l anstreben
• Organikanteil während der Elution der Analyten von größer als 10–20 % und kleiner als 90–95 % anstreben
• Optimale Flussraten für ESI: 0,05–0,3 ml/min
• Optimale Flussraten für APCI: 0,3–1 ml/min
3.2.2 Optimierung der Ionenquellenbedingungen
Nach der Ausarbeitung der LC-Trennmethode gilt es, die Geräteparameter des Massenspektrometers so zu optimieren, dass eine möglichst empfindliche Detektion der Zielanalyten gewährleistet wird. Dieses sog. Tuning ist für jede HPLC-MS-Methode individuell verschieden und sollte nicht mit der Kalibrierung verwechselt werden, bei der mittels definierter Referenzstandards genau bekannter molarer Masse und ggf. des Fragmentierungsverhaltens der Massenanalysator sowie der Ionendetektor des Massenspektrometers kalibriert werden. Zum MS-Tuning infundiert man zweckmäßigerweise in einer Fließinjektionsanalyse (FIA) mittels einer Spritzenpumpe eine Lösung von Referenzstandards des bzw. der Zielanalyten kontinuierlich in die Ionenquelle und optimiert die MS-Quellen- und Ionentransfereinstellungen entsprechend. Alternativ kann auch in einer Serie von einzelnen Injektionen in den Eluentenstrom mithilfe des LC-Autosamplers, die dann zu dezidierten Peaks im MS-Chromatogramm führen, optimiert werden. Im Falle der FIA empfiehlt es sich, die Tuninglösung der Referenzstandards mit etwa einem Zehntel der später in der Analyse erwarteten Konzentration anzusetzen. Als Infusionslösemittel dient idealerweise die Fließmittelzusammensetzung zum Zeitpunkt der chromatographischen Elution der Substanzzone. Falls diese nicht (näherungsweise) bestimmt werden kann, tut es auch die über das Gradientenprogramm gemittelte Laufmittelzusammensetzung, was jedoch mit einer gewissen Abweichung des Detektionsergebnisses in der späteren Trennung im Vergleich zu dem Tuningergebnis einhergeht. Die Flussrate entspricht derjenigen, die auch in der LC-Trennung zur Anwendung kommt. Sollte diese so hoch sein, dass sie mit einer üblichen Spritzenpumpe nicht sinnvoll gefördert werden kann, kann das reine Fließmittel von der UHPLC-Pumpe gepumpt werden, während eine Spritzenpumpe vor der Ionenquelle die Tuninglösung in aufkonzentrierter Form über ein T-Stück in den Eluentenstrom einspeist. Im Online-Monitoring-Modus der LC-MS-Software optimiert man nun, sofern das Massenspektrometer keine automatisierte Tuning-Routine besitzt, schrittweise die Quellenparameter nacheinander so, dass man zunächst eine gleichförmige Basislinie ohne Stufen, Einbrüche oder Signalspitzen (Spikes) erhält – das ideale Zeichen für einen stabilen Sprayprozess. Den stärksten Einfluss auf die Spraystabilität haben die Gasfluss- und -druckeinstellungen bei pneumatisch unterstützter Vernebelung sowie die Trocknungstemperatur in der MS-Ionenquelle. Eine höhere Signalstärke erzielt man hingegen durch vermehrte (selektive) Ionenausbeute sowie einen verstärkten
