Aufnahme eines Referenzdatensatzes für 1–5 min
• Auswertung von Signalstabilität, Qualität des Massenspektrums, Signal-zu-Rauschen und Massenauflösung
3.2.4 Überprüfung der Komplettmethode
Im abschließenden Schritt werden nun LC-Trennung und MS-Detektion methodenseitig zusammengeführt. Wer es eilig hat, installiert einfach die benötigte Trennsäule, koppelt die UHPLC-Anlage fluidisch mit dem MS-Ionenquelleneinlass und startet eine Trennung einer (matrixfreien) Standardlösung mit den separat optimierten Bedingungen für UHPLC und MS. Die Chance, dass dies auf Anhieb funktioniert, ist recht hoch. Oft muss man jedoch MS-Quellenparameter nachkorrigieren, weil sich in der Gradientelution die tatsächliche Elutionsmittelzusammensetzung für einen Analyten deutlich von der Zusammensetzung des Tuningexperimentes unterscheidet. Die auf eine isokratische Eluentenzusammensetzung hin optimierten Quellenparameter sind nicht optimal geeignet für deutlich abweichende Mischungsanteile an Wasser und Organik. Bevorzugt beobachtet man dies im wasserreichen, „nassen“ Bereich des Elutionsprogramms, wo es häufiger zu Tröpfchenbildung, erkennbar an Spikes in der Signalbasislinie, kommt. In Extremfällen muss man zu unterschiedlichen Zeiten des Chromatogramms mit individuell auf dieses Zeitsegment angepassten Quelleneinstellungen arbeiten. Die marktüblichen MS-Kontrollprogramme erlauben zwar keine kontinuierliche Änderung von Quellenparametern, wie z. B. einen Druckgradienten über die Zeit für das Vernebelungsgas. Zumindest aber ist die Unterteilung des Trennzeitfensters in unterschiedliche MS-Detektionssegmente möglich, für die unabhängige Einstellungen definiert werden können. Die Erfahrung zeigt aber, dass dies in vielen Fällen nicht nötig ist und man mit ein wenig Geschick rasch zu einem globalen Satz an MS-Einstellungen gelangt, mit dem über das komplette Elutionsfenster hinweg zuverlässig gearbeitet werden kann.
Wer lieber methodisch ausführlicher vorgeht, legt vor der ersten LC-MS-Trennung noch einen Zwischenschritt ein, in dem die UHPLC-MS-Kopplung einschließlich eingebauter Trennsäule apparativ lauffertig aufgesetzt, allerdings zwischen Säule und Massenspektrometer wieder wie beim MS-Tuning über ein T-Stück eine Spritzenpumpe angeschlossen wird. Man lässt dann die UHPLC-Anlage Blindgradienten ohne Probeninjektion durch den Probengeber fahren und speist wiederum eine Analytlösung hinter der Säule über das T-Stück kontinuierlich zu. Mit diesem Aufbau lässt sich rasch ermitteln, ob die beim MS-Tuning ermittelten MS-Detektionsparameter über den gesamten Gradientelutionsbereich hinweg ausreichend gute Resultate erlauben und wie sich das Analytsignal im Massenspektrometer in Abhängigkeit der Laufmittelzusammensetzung ändert. Gleichermaßen kann man anhand der Blindgradienten ohne Nachsäuleninfusion bestimmen, inwieweit sich das Basislinienrauschen über den Gradienten hinweg ändert, z. B. durch unsaubere Lösemittel, vermehrtes Säulenbluten oder Verunreinigungen aus der Apparatur. Für Realproben von hoher Bedeutung ist zudem die Bestimmung von Matrixeinflüssen (Ionensuppression), die auf ähnliche Weise mit einer Matrixlösung bestimmt werden kann [1]. Nach einer solchen Überprüfung der LC-MS-Methode auf ihre Tauglichkeit hin kann mit den üblichen Verfahrensschritten einer Methodenvalidierung fortgefahren werden.
Empfehlungen
• Die Basislinienstabilität kann mit den im MS-Tuning optimierten Einstellungen unter der sich ändernden Lösemittelzusammensetzung der Gradientelution in manchen Gradientenabschnitten leiden.
• Zeitsparender Ansatz zur Kopplung: Aufsetzen der gekoppelten Methode und Testinjektion mit gegebenenfalls erforderlicher Modifikation der Quelleneinstellungen
• Ausführlicherer Ansatz: Blindgradienten über die Trennsäule werden durch Nachsäuleninfusion einer Analytlösung im Massenspektrometer aufgezeichnet, bevor die Probe endgültig in der LC-MS-Trennung untersucht wird.
• Bestimmung von Matrixeinflüssen durch Nachsäuleninfusion
3.2.5 Unterstützung bei der Methodenentwicklung durch softwaregestützte Parametervariation
Wie die vorigen Abschnitte zeigten, bedeutet die Entwicklung und Optimierung einer LC-MS-Methode viele einzelne Schritte, die zu automatisieren einen deutliche Zeitersparnis bedeutet und durch eine umfassendere Untersuchung des Parameterraums auch zu robusteren Methoden führen kann. Der Markt bietet eine Vielzahl von Softwarepaketen, die sich mit der Simulation von Flüssigchromatogrammen, statistischer Versuchsplanung, Quality-by-Design-Konzepten und automatisierter Methodenentwicklung beschäftigen (s. Kap. 10, 11, 20). Es muss jedoch nicht immer gleich ein zusätzliches Expertenprogramm sein. Auch gängige Chromatographiedatensysteme (CDS) bieten mitunter bereits mit Bordmitteln intelligente Möglichkeiten, Maschinen automatisiert den Weg zu bestmöglichen Trenn- und Detektionsbedingungen suchen zu lassen. Ein Beispiel sei hier kurz beschrieben. Manche Chromatographiedatensysteme wie Thermo Scientific™ Chromeleon™ bieten die Möglichkeit, für Instrumentenmethodendateien eigene Variablen zu deklarieren (sog. Custom Variables) und diese beim Aufruf durch die Software mit Werten aus einer Sequenztabelle zu füllen (Abb. 3.2). Damit spart man sich den Aufwand, für jede geänderte Detektionseinstellung (oder auch LC-Trennbedingung) eine eigene Methodendatei anzulegen. Dies bietet eine elegante und zügige Möglichkeit, nicht nur LC-Trennungen automatisiert zu optimieren, sondern auch die MS-Detektionsbedingungen. Anwender:innen deklarieren die Parameter der unterstützten Ionenquellen als Methodenvariablen; das Erstellen der Sequenztabelle mit der inkrementellen Änderung der verschiedenen Quellenparameter für jede Injektion übernimmt anschließend die Software. Beim Abarbeiten führt dann das CDS jede Injektion mit den spezifisch geänderten Quelleneinstellungen durch. Im Anschluss kann mit den Filterwerkzeugen von Chromeleon der erzeugte Datensatz nach den Trennungen mit den besten Resultaten, z. B. Anzahl der detektierten Peaks, maximales Signal-zu-Rauschen-Verhältnis oder anderen Kriterien, durchsucht und übersichtlich dargestellt werden. Auf diese Art kann mit einem vertretbaren Aufwand ein beliebig feingerasterter Satz an Detektionseinstellungen für eine Musterprobe automatisiert in Messungen verwendet und anschließend ausgewertet werden, um die am besten geeigneten HPLC- und MS-Einstellungen für ein gegebenes Trennproblem zu ermitteln [6].
Abb. 3.2 Beispiel einer automatisiert erstellten Sequenztabelle zur automatisierten Ermittlung von optimalen MS-Ionenquelleneinstellungen für ein Single-Quadrupol-Massen- spektrometer mithilfe von selbstdeklarierten Variablen (Custom Variables) in Thermo Scientific Chromeleon 7. Angewandt wurden diese Bedingungen zur Qualitätskontrollanalytik in der Herstellung synthetischer Oligonukleotide [6].
3.3 Übertragen von HPLC-Bestandsmethoden an die Massenspektrometrie
Solange im regulierten Umfeld noch zahlreiche HPLC-Methoden Anwendung finden, die zu einer Zeit entwickelt und validiert wurden, in der LC-MS-Kopplung noch keinesfalls zur Routine gehörte – die Pharmakopöen der USA, Europas und Chinas sind voll davon –, wird es für den LC-Analytiker zum Aufgabenspektrum gehören, etablierte Bestandsmethoden ganz oder teilweise MS-gängig zu machen. Die Beweggründe dafür können verschiedener Natur sein. Verschärfte regulatorische Anforderungen, zum Beispiel für den Nachweis genotoxischer Verunreinigungen, erfordern mitunter heute Nachweisgrenzen und eine Detektionsselektivität, die zum Zeitpunkt der Methodenentwicklung noch nicht zugänglich waren, jetzt aber mittels Massenspektrometrie zu leisten sind. Auch eine neuartige, unbekannte Verunreinigung, die bei einer Qualitätskontrollanalytik oder der Prozesskontrolle auffällt, erfordert in der Regel eine massenspektrometrische Untersuchung. Letzteres sollte bei lang etablierten Herstellprozessen in der Medikamentenherstellung zwar nur noch selten auftreten, da man einen seit Jahren oder
