nicht kritisch ist. Eine einzelne 50 μl-Fraktion des 1D-Eluats (0,5 min × 0,10ml/min) wird nach der Verdünnung mit wässrigem Elutionsmittel mittels der 2D-Pumpe auf die 2D-Säule übertragen. Dieser Verdünnungsschritt ist wichtig, da er den Gehalt an organischem Lösungsmittel der in die 2D-Säule injizierten Probe reduziert, was zu einer ausgezeichneten Peakform im 2D-Chromatogramm führt, wie in Abb. 1.5b dargestellt.
Abb. 1.5 Identifizierung einer Verunreinigung in einem synthetischen farbstoffmarkierten Oligonukleotid unter Verwendung von LC-LC mit RP-Säulen in beiden Dimensionen. Die Verwendung unterschiedlicher Ionenpaarbedingungen in den beiden Dimensionen Hexylamin für die UV-Detektion, siehe (a), sowie Triethylamin + Hexafluorisopropanol für die MS-Kopplung, siehe (b), sorgt für eine komplementäre Selektivität, obwohl die Säulenchemie dieselbe ist, und macht die 2D-Trennung für den Nachweis durch Massenspektrometrie geeignet. Abdruck mit Genehmigung aus [29].
1.5.2 Beispiel Nr. 2 – umfassende 2D-LC-Trennung von Tensiden
In diesem zweiten Beispiel untersuchen wir die Verwendung von LC × LC zur Abtrennung von Tween 20 (auch bekannt als Polysorbat 20 oder PS20), einer komplexen Mischung von Fettsäureestern von ethoxyliertem Sorbitan. Der umfassende Modus von 2D-LC ist eindeutig am besten geeignet, um eine komplexe Mischung wie diese zu charakterisieren. Die in Abb. 1.6 gezeigte Trennung, die aus der Arbeit von Vanhoenacker et al. stammt [30], ist eine schöne Demonstration, wie sich HILIC- und RP-Trennungen bei der Verwendung in einem 2D-Trennformat gut ergänzen können. Unter den Bedingungen dieser Trennung trennt die 1D-HILIC-Säule die Moleküle in erster Linie auf der Grundlage der Anzahl der vorhandenen Oxyethylengruppen, wobei höher ethoxylierte Moleküle später in der ersten Dimension eluiert werden. Die 2D-RP-Säule hingegen trennt die Moleküle in erster Linie auf der Grundlage der Länge und der Anzahl der vorhandenen Fettsäureestergruppen. Eine Zusammenfassung der für diese Trennung verwendeten Bedingungen ist in Tab. 1.2 dargestellt. Die 1D-Säule wird mit einer Flussrate betrieben, die für eine 2,1 mm-i. d.-Säule als niedrig angesehen wird (30 μl/min), in erster Linie, damit das Volumen des in die 2D-Säule injizierten 1D-Eluats nicht zu groß ist (20 μl). Dies ist hier besonders wichtig, weil jede dieser Fraktionen mehr als 75 % organisches Lösungsmittel enthält, während jede 2D-Trennung mit 60 % organischem Lösungsmittel beginnt, und das meiste dieser organischen Stoffe ist MeOH, das für RP-Trennungen ein schwächeres Lösungsmittel als ACN ist. Eine Erhöhung der 1D-Flussrate und damit des Volumens des 1D-Eluats, der mit jeder Fraktion in die 2D-Säule injiziert wird, würde zu einer starken Verbreiterung der 2D-Peaks führen.
Tab. 1.1 Zusammenfassung der Bedingungen für die IPRP-IPRP-Trennung von farbstoffmarkierten Oligonukleotiden.
| Erste Dimension Säule: RP (C18); 50 mm × 2,1 mm i. d., 1,7 μm Gradientenelution von 66 bis 76 % B Lösungsmittel A: 100 mM Hexylamin-Acetat, pH 7 Lösungsmittel B: MeOH Durchflussrate: 0,10 ml/min Temperatur: 60 °C Injektionsvolumen: 1 μl Analysezeit: 30 min |
| Zweite Dimension Spalte: RP (C18); 50 mm × 2,1 mm i. d., 1,7 μm Gradientenelution von 20 bis 70 % B Lösungsmittel A: 15 mM Triethylamin, 400 mM Hexafluorisopropanol in Wasser, pH 8 Lösungsmittel B: MeOH Durchflussrate: 0,25 ml/min Temperatur: 60 °C Analysezeit (pro Fraktion): 20 min. |
| Schnittstelle Doppelte Ventile mit sechs Anschlüssen, mit direkter Überführung der Fraktion in die 2D-Säule |
Die 2D-Säule ist relativ kurz (50 mm), schmal (2,1 mm i. d.) und mit kleinen Partikeln (1,8 μm) gepackt, was die in der zweiten Dimension erforderlichen schnellen Trennungen begünstigt. Die Säulentemperatur beträgt 80 °C, was die Verwendung einer für diese Säule als hoch angesehenen Flussrate (2 ml/min) erleichtert [31]. Es werden steile Gradienten verwendet, sodass die Dauer jedes 2D-Zyklus nur 33 s beträgt, was dazu beiträgt, das Undersampling zu minimieren und die Trennung der 1D-Peaks, die von der 1D-Säule vor der Probenahme bereitgestellt werden, aufrechtzuerhalten.
Abb. 1.6 Trennung der Bestandteile von kommerziellem PS20 mittels LC × LC mit HILIC- und RP-Säulen in der ersten bzw. zweiten Dimension. Angepasst mit Genehmigung nach [30].
1.6 Ausblick
Zurzeit beobachten wir eine rasche Verbreitung von 2D-LC-Methoden in Anwendungsbereichen, die von der pharmazeutischen Analyse bis zur Lebensmittel- und Getränkeanalyse reichen. Die Zahl der 2D-LC-Anwender wächst schnell, parallel zu den kontinuierlichen Fortschritten der kommerziell verfügbaren Technologie für 2D-LC und dem verbesserten grundlegenden Verständnis der Technik. Ich erwarte, dass wir in naher Zukunft sorgfältige und kritische Bewertungen der Robustheit dieser Technologie sehen werden. Dies wird für die breitere Nutzung der Technik wichtig sein, da verschiedene Branchen die Möglichkeit der Implementierung von 2D-LC-Methoden in regulierten und Qualitätskontrolllabors in Betracht ziehen. Die Entwicklung schlankerer Ansätze zur Methodenentwicklung (im Gegensatz zu den oben diskutierten erfahrungsbasierten Ansätzen), die wahrscheinlich von der Entwicklung von Software-Werkzeugen für diesen Zweck erheblich profitieren werden (In-Silico-Ansätze), ist dringend erforderlich und wird eine große Wirkung haben, wenn sie in der Praxis eingesetzt werden können. Gegenwärtig werden fast alle mehrdimensionalen LC-Trennungen auf Zeitbasis durchgeführt, d. h. die 1D-Trennung und die anschließende 2D-Trennung von 1D-Eluatfraktionen werden nacheinander durchgeführt. Parallel durchgeführte 2D-Trennungen wären vor diesem Hintergrund attraktiv. Solche Trennungen wurden bereits vor Jahrzehnten untersucht [32], standen damals aber vor ernsthaften technischen Herausforderungen. Diese Ideen werden jetzt vor allem von der Schoenmakers-Gruppe [33] wieder aufgegriffen, und derartige 3D-Trennungen könnten dank der explosionsartigen Zunahme der 3D-Druckmöglichkeiten in der Praxis eingesetzt werden, besonders für sehr komplexe Proben. Schließlich wird sich die Forschung in Bezug auf 2D-LC auf Strategien zur Datenanalyse konzentrieren, damit die Anwender leichter die Informationen aus datenreichen Chromatogrammen, wie in Abb. 1.6 dargestellt, extrahieren können.
Tab. 1.2 Zusammenfassung der Bedingungen für die HILICxRP-Trennung von PS20.
| Erste Dimension Spalte: HILIC (nackte Kieselsäure); 100 mm × 2,1 mm i. d., 1,8 μm Gradientenelution von 98 bis 0 % B Lösungsmittel A: 10 mM Ammoniumformiat, pH 3 in 50/50 ACN/Wasser Lösungsmittel B: ACN Durchflussrate: 30 μl/min Temperatur: 30 °C Injektionsvolumen: 1 μl Analysezeit: 120 min |
| Zweite Dimension Spalte: RP (C18); 50 mm × 2,1 mm i. d., 1,8 μm Gradientenelution von 20 bis 100 % B Lösungsmittel A: 5 mM Ammoniumformiat, pH 3 in 50/50 MeOH/Wasser Lösungsmittel B: 5 mM Ammoniumformiat, pH 3 in 50/50 Ethylacetat/MeOH Durchflussmenge: 2 ml/min Temperatur: 80 °C Analysezeit (pro Fraktion): 33 s |
| Schnittstelle Doppelschleifen-Design mit 20 μl-Schleifen, im Gleichstrommodus betrieben |
Danksagung
Ich möchte Dr. Gabriel Leme für die Erstellung von Abb. 1.1 danken.
Literatur
1 Venkatramani, C.J., Al-Sayah, M., Li, G., Goel, M., Girotti, J., Zang, L., Wigman, L., Yehl, P. und Chetwyn, N. (2016). Simultaneous achiral-chiral analysis of pharmaceutical compounds using two-dimensional reversed phase liquid
