Получение и очистка антител
Поликлональные антитела получают путем иммунизации лабораторных животных. Обычно для этих целей используют кроликов, морских свинок или коз. Важно соблюдать принцип чужеродности иммуногена. Установлено, что чем сильнее антиген отличается по своей структуре от гомологичного антигена иммунизируемого животного, тем выше его иммуногенность. Например, инсулины человека и кролика имеют близкую первичную структуру, и поэтому для кролика инсулин человека малоиммуногенен. Между инсулином человека и морской свинки имеются достаточные отличия, что позволяет использовать этих животных как продуцентов соответствующих антисывороток (Фримел Г. М., 1987; Herschowitz H. I. D., 1985).
В общем случае способность антигена стимулировать продукцию антител зависит от ряда факторов. Так, с повышением молекулярной массы полимерных молекул повышается их иммуногенность. Для белков пороговый размер молекулы, определяющий появление иммуногенности, – 7 – 10 аминокислот. Это количество аминокислот, позволяющее сформировать α-спираль. Кроме этого, иммуногенность растет с повышением количества повторяющихся антигенных детерминант в составе антигена и зависит от жесткости структуры антигена, т. е. способности сохранять определенную структуру. Иммуногенность одного и того же антигена зависит от генотипа и может различаться у индивидуумов, имеющих разные отдельные варианты генов главного комплекса системы гистосовместимости, поэтому обычно одновременно иммунизируют нескольких животных (Фримел Г. М., 1987).
Слабоиммуногенные антигены необходимо вводить со стимуляторами иммуногенеза (адъювантами). Наиболее часто используют адъювант Фрейнда, в состав которого входят смесь минеральных масел, эмульгатор и убитые микобактерии. Использование в иммунизации адъюванта снижает возможность появления толерантности, позволяет расширить диапазон концентраций вводимого иммуногена от 50 до 200 мкг на одну инъекцию. Однако после введения адъюванта у животных часто образуются гранулемы, которые влияют на самочувствие, поэтому в течение иммунизации необходимо тщательно наблюдать за состоянием здоровья животного.
В ходе первичного иммунного ответа обычно образуются иммуноглобулины класса IgM, продукция которых сменяется синтезом иммуноглобулинов других изотипов. Получаемые описанным выше способом антитела в большей части относятся к IgG-фракции иммунной сыворотки. Однако ответ на некоторые антигены ограничивается синтезом IgM-антител (Haunghton G. [et al.], 1993).
В сывороточных средах содержание антител не превышает 10 % общего количества белка, поэтому для удаления примесных белков и ДНК необходимы высокоэффективные методы очистки. Для очистки антител применяется фракционирование сульфатом аммония. Последующая ионообменная хроматография обеспечивает чистоту антител на уровне только 90 %, поэтому для дальнейшей очистки необходимо использовать дополнительные
