в ткани, метка не влияет на конформационные изменения после взаимодействия антител с антигеном.
В качестве меток изначально использовались различные флуорохромы, дающие излучение в видимом диапазоне спектра при облучении их светом с определенной длиной волны, но для их использования требуется наличие флуоресцентного микроскопа с набором барьерных фильтров. Кроме этого, такие препараты нельзя хранить из-за быстрого затухания флуоресценции.
Для того чтобы препараты можно было исследовать с помощью обычной световой микроскопии и долго хранить, были разработаны методы получения стабильных окрасок. Наиболее простой меткой являются металлы, например коллоидное золото. В результате реакции «антиген – антитело» в месте скопления антител в световом микроскопе обнаруживается окрашивание. Допустимо использование радиоизотопов, однако их применяют очень редко из-за высокой опасности облучения персонала. Наибольшее распространение получили ферментные метки, например HRP, AP и глюкозоксидаза. Для каждого указанного фермента существует несколько субстратов, которые под действием фермента образуют нерастворимые красители различных цветов. Необходимо учитывать, что пероксидаза и AP есть и в тканях организма, поэтому иногда можно получить ложноположительные результаты. Пероксидаза содержится в большом количестве в нейтрофилах и эозинофилах, поэтому для окраски мазков крови, костного мозга и срезов иммунокомпетентных органов использование этого фермента не рекомендуется. При окраске других тканей небольшая пероксидазная активность блокируется добавлением перекиси водорода перед инкубацией с первичными антителами. AP содержится во многих тканях, поэтому во время инкубации с субстратом в него добавляют левамизол (ингибитор AP). Необходимо помнить, что AP клеток кишечника и плаценты не ингибируется левамизолом, поэтому для этих тканей лучше использовать другие ферменты. Глюкозоксидаза может использоваться без ограничений, так как в тканях млекопитающих не встречается. Если чувствительности такой системы недостаточно, то дополнительно используют антитела против пероксидазы или AP. Эти антитела связываются с антигенсвязывающим участком вторичных антител, что увеличивает чувствительность метода еще в 2 раза.
Следующий шаг на пути повышения чувствительности метода – иммуноокрашивание с использованием биотинавидинового комплекса. Биотин – это стойкое к действию высоких температур и широкому диапазону рН соединение, которое хорошо растворяется в воде и спирте. Биотин легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами. При использовании биотина немеченые первичные антитела соединяются с антигеном; меченные биотином вторичные антитела соединяются с первичными; добавляется комплекс «авидин – биотин – фермент», который присоединяется к биотину вторичных антител. Данный метод был назван ABC-методом (аббревиатура от английского avidin and biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular сomplex). Авидин может быть заменен на стрептавидин – белок с молекулярной массой около 60 кДа, который получают из микроорганизмов Streptomyces avidinii.
В отличие от
