реагентами состоит в малых размерах конъюгата, за счет чего обеспечивается лучшее проникновение вторичных антител к местам связывания первичных. При этом должна увеличиться и чувствительность реакции.
Нередко при постановке иммуногистохимических реакций даже с использованием высокочувствительных систем детекции связавшихся первичных антител исследователь сталкивается с проблемой недостаточной иммунореактивности, которую не удается решить, используя более высокие концентрации антител и увеличивая продолжительность инкубации. Методы демаскирования антигена – один из подходов, который позволяет существенно увеличить чувствительность реакции (см. гл. 5). Кроме него возможно применение и других приемов.
В тех случаях, когда продукт реакции отчетливо определяется в окрашенных препаратах, но желательно добиться его большей оптической плотности и контрастности, можно использовать метод тонирования DAB-продукта солями никеля или кобальта (Mullink H. [et al.], 1992). В ряду коммерческих наборов, предназначенных для выявления пероксидазы бензидиновой реакцией, имеются и такие, в которых реализована возможность никелевого тонирования. Применение солей никеля ведет к усилению интенсивности гистохимической реакции на пероксидазу и меняет цвет продукта реакции: он становится не желто-коричневым, а черным.
Усиления реакции можно достичь, проводя реакцию с мечеными вторичными антителами в сочетании с дополнительной реакцией с другими мечеными вторичными антителами, выработанными против иммуноглобулинов животного происхождения – источника первых вторичных антител. Такой подход позволяет увеличить концентрацию маркерного фермента (либо флуорохрома) в месте локализации продукта «антиген – антитело».
Наибольшего увеличения чувствительности реакции можно добиться, используя наборы, усиливающие реакцию при помощи тирамида (Bobrow M. N. [et al.], 1989; 1992). Применение конъюгатов тирамида в ИГХ основано на способности тирамида, при каталитическом влиянии пероксидазы, образовывать нерастворимое соединение в локусе действия фермента. Тирамид может быть помечен как флуорохромом, так и биотином, что дает возможность использования тирамидной амплификации не только при проведении флуоресцентной микроскопии, но и при обычной микроскопии в проходящем свете.
Таким образом, в настоящее время для исследователя доступен широкий спектр методов визуализации продукта иммуногистохимической реакции. Выбор конкретного способа должен определяться с учетом задачи исследования, предполагаемой концентрации антигена в изучаемом материале и наличия соответствующей приборной базы.
Литература
Bobrow M. N., Harris T. D., Shaughnessy K. J. [et al.]. Catalyzed reporter deposition: A novel method of signal amplification: Application to immunoassays // Journal of Immunological Methods. – 1989. – Vol. 125. – P. 279 – 285.
Bobrow M. N., Litt G. J., Shaughnessy K. J. [et al.]. The use of catalyzed reporter deposition as a means of signal amplification in a variety of formats // Journal of Immunological Methods. – 1992. – Vol. 150, № 1 – 2. – P. 145 – 149.
Mullink H., Vos W., Jiwa M., Horstman A. [et al.]. Application and comparison of silver intensification methods for the diaminobenzidine
