% para eliminar el exceso de ácido tánico y concentrar los glóbulos rojos al 100 %.
▪ Sensibilización de glóbulos rojos
1. Diluir el antígeno de E. histolytica a su concentración óptima utilizando PBS pH 7.2.
2. Diluir los glóbulos rojos tratados con ácido tánico y concentrados al 100 % en la dilución óptima del antígeno hasta obtener una concentración de células del 2 %.
3. Incubar a 37 °C durante 50 minutos, mezclando simultáneamente.
4. Centrifugar y lavar las células dos veces en solución salina al 0.85 %.
5. Suspender los glóbulos rojos al 2 % en solución salina al 0.85 %.
▪ Titulación del antígeno de E. histolytica
1. Realizar diluciones seriadas del antígeno (1:2) en PBS pH 7.2, partiendo de una dilución 1:10 y finalizando en 1:40.
2. Aplicar la técnica de microhemaglutinación con los correspondientes sueros controles positivos y negativos.
La dilución óptima del antígeno es la dilución máxima capaz de reaccionar con la dilución más alta del suero control positivo.
▪ Técnica de microhemaglutinación
1. Inactivar los sueros de control (positivo y negativo) y los sueros problema a 56 °C durante 30 minutos.
2. Preparar una dilución de suero de conejo al 2 % en PBS pH 7.2.
3. Agregar 50 µl de suero de conejo diluido al 2 % a 12 pozos de la placa de microtitulación.
4. Agregar 50 µl de cada suero inactivado en los pozos destinados a los sueros problema, control positivo y control negativo.
5. Realizar diluciones sucesivas, transfiriendo 50 µl a los pozos inferiores hasta obtener una dilución 1:4000 y eliminar la última dilución.
6. Agregar 25 µl de glóbulos rojos sensibilizados con el antígeno de E. histolytica a todos los pozos.
7. Mezclar con suavidad por agitación, dejar en reposo de 2 a 3 horas y cubrir la placa con papel celofán.
8. Realizar la lectura de la prueba. Si existen anticuerpos contra E. histolytica, se observará una malla de aglutinación, lo que se considera una prueba positiva en la dilución correspondiente. En la prueba negativa, se observa un punto en el fondo del pozo.
Western blot
El western blot es una técnica inmunológica que ayuda a determinar la presencia de proteínas de cierto peso molecular en pacientes con infección por E. histolytica reciente o pasada. En un estudio realizado en pacientes colombianos diagnosticados con absceso hepático amibiano, se identificó una banda de 38 kDa en el 93 % de los pacientes, una de 42 kDa en el 90 % y una de 80 kDa en el 86 %. En pacientes con absceso hepático mixto, las bandas de 80 kDa y 38 kDa fueron identificadas en el 100 % de los pacientes y la de 42 kDa, en el 75 % de ellos (60).
En otro estudio, que evaluó la frecuencia de bandas entre pacientes con infección reciente y pasada por E. histolytica, se encontraron bandas de 136 kDa, 132 kDa, 93 kDa, 70 kDa y 62 kDa en pacientes con absceso hepático amibiano, y bandas de 144 kDa, 140 kDa y 94 kDa asociadas con infección pasada (61). La figura 1.5 muestra el procedimiento de la realización de western blot para la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE, por su sigla en inglés) en medio discontinuo denaturante y la detección de anticuerpos anti-E. histolytica.
Figura 1.5. Procedimiento para la realización del western blot.
Fuente: cortesía de Olga Lucía Morales Reyes.
Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico en medio discontinuo denaturante
▪ Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: un par de vidrios con separadores; un peine del grosor de los separadores; un par de sujetadores (clamps) para vidrios; un stand para colocar el sándwich de electroforesis; cámaras de electroforesis; fuente de poder ajustable a corriente continua; tubos plásticos para centrífuga; baño serológico a ebullición; agua bidestilada; agua saturada con N-butanol (ver anexo 47) —este reactivo es opcional—; solución A: monómero para gel de separación (ver anexo 48); solución B: buffer para gel de separación (ver anexo 49); solución C: monómero para gel de stacking (ver anexo 50); solución D: buffer para gel de stacking (ver anexo 51); persulfato 2 % (ver anexo 52); gel de sellado (ver anexo 53); gel de corrido o separación (ver anexo 54); gel de stacking (ver anexo 55); buffer de Laemmli 2X o 4X (ver anexo 56); buffer de corrido (ver anexo 57); pipetas de 10 ml; micropipetas; tetrametiletilendiamina (TEMED); puntas para micropipetas; pipeteador; bisturí; guantes, y tapabocas.
▪ Precaución
Se debe siempre utilizar guantes de protección química EN374, a fin de evitar que los vidrios se engrasen y para protección personal, ya que los monómeros de acrilamida son neurotóxicos.
▪ Procedimiento
1. Lavar los vidrios, preferiblemente, con detergente 1A y agua abundante y manipularlos con sumo cuidado.
2. Secar los vidrios con papel absorbente, teniendo la precaución de que no queden residuos de grasa, jabón o papel.
3. Ensamblar la cámara de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Preparar 1 ml de persulfato de sodio al 2 %.
▪ Preparación del gel de sellado
1. Preparar el gel de separación sin aplicar persulfato ni TEMED. Para ello, agregar agua bidestilada, solución A y B.
2. En otro recipiente, separar 1 ml de la mezcla para gel de separación y agregar el persulfato y el TEMED. Servir con rapidez para evitar la polimerización.
3. Agregar 300 µl de la mezcla del gel de sellado en el sándwich de los vidrios, procurando hacerlo con rapidez y por las esquinas del montaje. Esperar que el gel polimerice de 20 a 30 segundos.
▪ Preparación del gel de separación
1. Agregar persulfato y TEMED a la solución de gel de separación restante.
2. Añadir la solución al sándwich de vidrios. Para ello, se utiliza una micropipeta de 1 ml (mínimo) y se vierte la solución con rapidez por las esquinas del montaje; se agregan aproximadamente 4 ml entre los vidrios a fin de dejar libre el espacio correspondiente al gel de stacking.
3. Agregar 450 µl etanol antes de que la acrilamida se polimerice. El etanol formará una capa a nivel a través de la superficie del gel en 1 o 2 minutos. Cuando el gel se polimerice, se observará una interfase nítida entre el etanol y el gel. En ese momento, retirar el etanol y secar con papel filtro.
4. Si el gel no se va a utilizar el mismo día, agregar agua bidestilada y 1 ml de solución B diluida 1:4. Almacenar
