Controles positivos para E. histolytica y E. dispar: Los controles positivos utilizados son las cepas de referencia HM1:IMSS para E. histolytica y SAW 760 para E. dispar.
• Control negativo: Como control negativo, se utiliza una cepa de Entamoeba invadens.
• Recuento celular: Realizar tres lavados con solución tampón de fosfatos a 4 °C (PBS 0.02 M, pH 7.4) (ver anexo 29) a 700 g y 4 °C durante 5 minutos y resuspender el sedimento en la misma solución. Llevar a cabo el recuento celular en cámara de Neubauer para calcular la cantidad de ADN esperada luego del proceso de extracción, con la siguiente fórmula:
N.° promedio de trofozoítos/volumen de resuspensión x 10 000 = N.° de trofozoítos/ml
Después del recuento, se realiza una centrifugación con las mismas condiciones utilizadas en los lavados. Luego, el sedimento se congela a -196 °C en nitrógeno líquido y se almacena a -20 °C hasta la extracción del ADN (44).
• Procesamiento de muestras: Para el procesamiento de muestras, primero, es necesario cultivar las muestras de materia fecal positivas por microscopía para el complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii en medio de Robinson para realizar el aislamiento primario (ver anexo 30) (45). Después de 8 días de observación, descartar los aislamientos negativos. Con los aislamientos positivos, realizar repiques sucesivos cada 48 horas como se describe en el aparte sobre mantenimiento de cultivos mixtos. Para finalizar, se hace el recuento celular de la manera antes descrita.
Extracción de ADN mediante lisis no alcalina
El proceso de lisis no alcalina es una modificación de la lisis alcalina, en el cual se prescinde del uso de ditiotreitol (DTT) e hidróxido de sodio (NaOH) en el proceso inicial de la lisis. Esta modificación ha sido descrita en procesos de extracción de ADN de protozoarios intestinales (25,43,46-51,52).
Procedimiento
1. Incorporar Tris-HCl 2M pH 8.3 (ver anexo 31) directamente al concentrado celular congelado y mantenido sobre hielo. Mezclar la suspensión con suavidad y purificar el ADN con 250 μl de fenol equilibrado/cloroformo/alcohol isoamílico (PCI, por su sigla en inglés), en una relación 25:24:1.
2. Separar las fases mediante centrifugación a 800 g durante 2 minutos en minicentrífuga. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo, en el cual se realiza una segunda purificación con un volumen de cloroformo.
3. Precipitar el ADN de la segunda fase acuosa en acetato de amonio 2 M (ver anexo 32) y dos volúmenes de etanol absoluto a 20 °C. Mezclar por inversión muy suavemente e incubar durante toda la noche a -20 °C.
4. Centrifugar a 1000 g y 4 °C durante 5 minutos. Resuspender el sedimento obtenido en 500 μl de etanol al 70 % e incubar durante 10 minutos a 20 °C. Centrifugar a 1500 g y 4 °C durante 10 minutos.
5. Evaporar completamente el etanol. Resuspender el ADN en 100 µl de buffer Tris Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, por su sigla en inglés) 10 mM (ver anexo 33).
6. Correr una electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % (ver anexo 34) y almacenar el ADN extraído a -20 °C hasta su utilización en la PCR.
7. Cuantificar el ADN mediante espectrofotometría.
Protocolo de reacción en cadena de polimerasa
1. Realizar la amplificación en un volumen final de 20 µl. Los cálculos por muestra son: 2 µl de buffer 1X (Sigma®), 1 μl de mezcla de dNTP’s 1.25 mM (Invitrogen®), 2.4 µl de MgCl2 6 mM (TucanTaq®), 0.2 μl de cada uno de los tres oligos 0.2 µM, 0.2 μl de polimerasa Taq (TucanTaq®) 0.05 U/µl, 4 μl de ADN y agua ultrapura estéril para completar el volumen final.
2. Iniciar la programación del termociclador con una primera desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 1 minuto, 58 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 1 minuto, y una extensión final a 72 °C durante 10 minutos.
3. Utilizar geles de agarosa al 1.5 % (ver anexo 35) teñidos con bromuro de etidio para la visualización de productos de la electroforesis corrida a 105 V/cm durante 45 minutos. La combinación de oligonucleótidos en una misma mezcla de reacción genera productos de 166 pb para el ADN de E. histolytica y de 752 pb para el ADN de E. dispar.
La secuencia del oligonucleótido sentido (EntaF) se diseñó sobre la región central de la subunidad pequeña del gen rRNA, la cual está conservada en ambas especies de Entamoeba, mientras que los oligonucleótidos antisentido (EhR y EdR), específicos para E. histolytica y E. dispar, se diseñaron según las secuencias variables de la subunidad pequeña del rRNA 16S. Las secuencias son EntaF: 5’-ATG CAC GAG AGC GAA AGC AT-3’; EhR: 5’-GAT CTA GAA ACA ATG CTT CTC T-3’, y EdR: 5’-CAC CAC TTA CTA TCC CTA CC-3’. La especificidad de los oligonucleótidos se establece al comparar con la totalidad de secuencias disponibles en GenBank, donde el oligonucleótido sentido (EntaF) se encuentra solo en el género Entamoeba y los oligonucleótidos antisentido (EhR y EdR), en secuencias específicas de cada una de las especies del complejo (53).
Diagnóstico de la amibiasis extraintestinal
Para el diagnóstico de la amibiasis extraintestinal, se utilizan pruebas inmunológicas que detectan anticuerpos. A pesar de que estos anticuerpos permanecen durante largo tiempo en el suero, su asociación con los hallazgos clínicos e imagenológicos es fundamental para el diagnóstico etiológico correcto (54). Entre las pruebas más utilizadas, se pueden hallar la aglutinación en látex, inmunodifusión (ID), contrainmunoelectroforesis (CIE), hemaglutinación indirecta (HAI), ELISA y western blot (WB).
La identificación de E. histolytica se lleva a cabo en material del absceso hepático, peritoneo, material expectorado y piel. Entre las fortalezas de estas pruebas figura su aporte en el desarrollo de estudios seroepidemiológicos, que indican el nivel de saneamiento básico de la población (33,55).
Técnicas inmunológicas
Las técnicas inmunológicas que se utilizan de rutina para la detección de anticuerpos son ID, CIE y ELISA.
Inmunodifusión
La inmunodifusión, llamada también análisis de Ouchterlony, es una técnica de precipitación sencilla basada en el principio de la reacción antígeno-anticuerpo, en la cual el antígeno soluble y el anticuerpo homogenizado se difunden a través de un medio semisólido y forman complejos inmunes estables que pueden ser visualizados como una banda de precipitación. Este método se realiza sobre agar en una caja de Petri o una placa de vidrio y las soluciones de antígeno y anticuerpo se colocan en pozos adyacentes, permitiendo que difundan el uno hacia el otro (56).
La localización de las bandas de precipitación depende de las concentraciones relativas de antígeno y anticuerpo que se colocan en los pozos. Si la concentración del antígeno es menor que la del anticuerpo, entonces el anticuerpo se difundirá más lejos del pozo para reaccionar con el antígeno. Si el anticuerpo está relativamente diluido en comparación con el antígeno, las bandas de precipitación tienden a formarse más cerca del pozo que contiene el anticuerpo. Asimismo, el tamaño molecular del antígeno y del anticuerpo influye en la formación de las bandas de precipitación. Los componentes de alto peso molecular, tales como las moléculas de IgG, tienden a difundirse con lentitud en el gel y, por lo tanto, sus bandas de precipitación se formarán más cerca al pozo donde están estos anticuerpos (56). La figura 1.4.
