gel de stacking
1. Preparar la solución de gel de stacking.
2. Agregar la solución al sándwich de vidrios como se explicó antes. Por cada gel se utilizan aproximadamente 2.5 ml de esta solución. Llenar por completo el espacio disponible en el sándwich para este gel.
3. Introducir con cuidado el peine de plástico y evitar la formación de burbujas, porque inhiben la polimerización de la acrilamida y causan distorsión local en el fondo de los pozos.
4. Esperar por lo menos 10 minutos a que el gel polimerice.
Se recomienda no correr patrones de peso molecular en los pozos de los extremos del gel.
▪ Preparación de la muestra
1. Mezclar tres partes de la muestra con una parte de buffer Laemmli 4X; si el buffer es 2X, la relación entre muestra y buffer es de 1:1. Mezclar y llevar a ebullición durante 5 minutos. Ejemplo: 80.33 µl de antígeno + 66.67 µl PBS 1X + 50 µl buffer Laemmli 4X.
2. Retirar el peine. Para correr una sola muestra se pueden cortar los dientes restantes con bisturí, limpiando bien los restos del gel. Llevar a cabo el montaje del sándwich en la cámara de electroforesis.
3. Agregar buffer de corrido entre los bloques de la cámara para verificar que no se salga.
4. Colocar el sándwich y la cámara superior en su sitio, llenar con buffer de corrido por dentro y por fuera de la cámara hasta aproximadamente la mitad del nivel de contenedor.
5. Servir la muestra en los pozos con una pipeta. El patrón puede depositarse en uno de los pozos centrales del gel.
▪ Corrido electroforético
1. Colocar los electrodos en su lugar, asegurando que el cátodo quede en la parte superior.
2. Fijar la fuente de poder en la selección de corriente constante.
3. Correr la electroforesis inicialmente a 75 V por 15 minutos aproximadamente y cuando la muestra se acumule al fondo de los pozos, cambiar a un voltaje constante de 125 V. Dejar que el corrido continúe bajo estas condiciones durante 1 hora.
4. Detener el corrido cuando el frente de color esté en el borde del gel.
5. Sacar la cámara del contenedor y continuar con la transferencia.
Electrotransferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa
▪ Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: cámara de electrotransferencia, dos hojas de papel Whatman de 3 mm x 14 cm x 16 cm, una hoja de papel de nitrocelulosa de 14 cm x 16 cm, buffer de transferencia (ver anexo 58), guantes, tubo de ensayo grande y cuarto frío o recipientes con hielo para enfriar la cámara de transferencia.
▪ Procedimiento
Precaución: utilizar guantes durante todo el procedimiento y manipular con cuidado el papel de nitrocelulosa para evitar que se ensucie. Iniciar el procedimiento lo más pronto posible después de terminar la electroforesis, a fin de disminuir la difusión de bandas.
1. Llenar la cámara de electrotransferencia con cantidad suficiente de buffer de transferencia.
2. Depositar el gel de corrido —el gel de stacking no es necesario para la transferencia— sobre una de las hojas de papel Whatman y colocarlo sobre una de las rejillas con espuma.
3. Colocar el papel de nitrocelulosa encima del gel y eliminar las burbujas. Colocar encima la otra hoja de papel Whatman y hacer presión sobre el montaje, al rodar un tubo de ensayo limpio sobre el papel Whatman para eliminar las burbujas entre el gel y el papel de nitrocelulosa.
4. Colocar encima la otra espuma y la otra rejilla. Asegurar el montaje y colocarlo en la cámara de electrotransferencia, confirmando que el papel de nitrocelulosa quede hacia el ánodo (+).
5. Programar las condiciones de la transferencia. Si se realiza con dos membranas se programan 150 mA durante 2 horas y media, mientras que, para un solo gel, se tarda 1 sola hora. La transferencia se hace a 4 °C, ya que el proceso puede ocasionar el calentamiento excesivo de la cámara.
Coloración de la transferencia con rojo Ponceau
▪ Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: rojo Ponceau (ver anexo 59), agua bidestilada, refractaria y solución para lavados (ver anexo 60).
▪ Procedimiento
1. Colocar la membrana en una refractaria limpia.
2. Lavar la membrana de nitrocelulosa con agua bidestilada.
3. Añadir rojo Ponceau en cantidad suficiente para cubrir la membrana y dejar en remojo durante 5 minutos.
4. Decolorar la membrana con agua bidestilada o solución de lavado para inmunoblot. Comprobar la aparición de bandas coloreadas de rojo, lo que indica el éxito de la transferencia. Lavar hasta que las bandas desaparezcan por completo.
Inmunoblot y revelado con fosfatasa
▪ Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: solución de trabajo PBS+Tween 20 PBS-T20 (ver anexo 14), solución para lavados (ver anexo 60), solución bloqueadora de actividad endógena (ver anexo 61), solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión (ver anexo 62) y solución activadora de la fosfatasa y solución reveladora (ver anexo 63).
▪ Procedimiento
1. Cortar la membrana en tiras de 0.6 cm de ancho, con cuidado de no cortar por el medio del frente de corrida de las bandas. Identificar uno de sus extremos con una marca de lápiz y colocar las tiras en tubos de ensayo limpios y llenos de agua bidestilada.
2. Colocar las tiras en solución bloqueadora de actividad endógena por 1 hora y luego realizar tres lavados con solución de lavado durante 5 minutos.
3. Colocar las tiras en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión y mantener a 4 °C y en agitación constante durante toda la noche; esto permite que las proteínas de la leche utilizada en la solución bloqueadora se peguen a los espacios vacíos de la membrana. El bloqueo también puede realizarse a 37 °C durante 1 hora.
4. Diluir la muestra (suero o sobrenadante) en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión recién preparada. La dilución del suero depende de la concentración de anticuerpos de este y de la concentración de proteínas en la transferencia, por lo cual inicialmente se deben probar diferentes diluciones (1:50, 1:100).
5. Incubar a 4 °C toda la noche o 1 hora a temperatura ambiente, con agitación constante. Luego, lavar la membrana cinco veces por 5 minutos en cada oportunidad con solución de trabajo PBS-T20.
6. Diluir el conjugado (anti-IgG o anti-IgM) en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión.
