Dejar las fiolas en incubación a 28 °C por 28 días en presencia de luz (día y noche) y con agitación ligera (cada 24 horas). La embrionación debe controlarse de manera microscópica a partir del día 20; cuando el 80 % de los huevos esté embrionado, la muestra estará lista para ser administrada a animales o para continuar con el procedimiento de obtención de larvas y del antígeno secretorio/excretorio.
Descortezamiento de los huevos y obtención de larvas II de Toxocara canis Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: vasos de precipitado, probetas, balanza, agitador magnético, incubadora a 37 °C, microscopio, portaobjetos, cubreobjetos, guantes, tubos plásticos para centrífuga, solución descortezadora (ver anexo 9), solución equilibrada de Hanks (ver anexo 10), medio de cultivo de larvas de Toxocara canis, pipetas automáticas y puntas, papel indicador de pH y campana de CO2.
Materiales y reactivos estériles
Los materiales y reactivos estériles necesarios para este método son: fiolas, frascos, probetas, gasas, tubos de tapa rosca, medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle (DME, por su sigla en inglés) (ver anexo 11), microscopio invertido y pipetas Pasteur.
Procedimiento
1. Lavar los huevos de Toxocara canis con solución salina al 0.85 % tres veces durante 3 minutos a 500 g. Repetir los tres lavados con agua desionizada.
2. Medir la cantidad de sedimento remanente (±5 ml).
3. Preparar la solución descortezadora.
4. Colocar la suspensión obtenida en agitación suave a 37 °C por 2 horas. Revisar el proceso al microscopio cada 30 minutos.
5. Centrifugar para eliminar la solución descortezadora.
6. Lavar con agua destilada estéril de 5 a 10 veces, centrifugando a 800 g por 5 minutos. Realizar el último lavado con solución equilibrada de Hanks en centrífuga refrigerada a 850 g.
7. Recolectar el sedimento en un tubo, realizar el recuento y hacer los cálculos respectivos:
Ejemplo:
2 ml→160 larvas
X→10 000 larvas
X = 125 ml de solución equilibrada de Hanks. Adicionar 200 ml
de solución equilibrada de Hanks para compensar las pérdidas.
10 000 larvas → Aproximadamente 5 ml de medio DME.
8.Agregar 200 larvas por tubo. Teniendo en cuenta las pérdidas, pueden obtenerse 17 tubos y 2 controles de medio.
9.Incubar los tubos a 37 °C en atmósfera de CO2 al 10 % y de medio de DME.
Preparación del medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle para mantenimiento de larvas II de Toxocara canis
1. Preparar 1000 ml de medio con H2O destilada estéril.
2. Retirar una alícuota de 100 ml con NaHCO3 y medir el pH.
3. La solución de bicarbonato es una solución volátil y es estable por 1 mes si se guarda en condiciones apropiadas (tubos de tapa rosca a 4 °C; pH 7.0±0.2).
4. Adicionar penicilina (1000 UI/ml) y estreptomicina (250 mg/ml).
5. Mantener el medio restante en refrigeración.
6. Servir 5 ml de medio en cada tubo tapa rosca.
7. Agregar las larvas a cada tubo (10 000):200, dejando 2 tubos como controles.
8. Incubar a 37 °C en atmósfera de CO2 al 10 %.
9. Verificar cada 3 días la movilidad de las larvas agitando el medio y observando en el microscopio invertido. Recoger el sobrenadante (3 ml aproximadamente) cada 7 días.
10. Agitar de nuevo el día previo a la obtención del antígeno excretorio/secretorio.
11. Reponer el volumen con medio DME fresco (3 ml).
Diagnóstico serológico para detección de anticuerpos tipo IgG anti Toxocara canis mediante ensayo inmunoenzimático
A continuación, se presentan las condiciones experimentales necesarias para llevar a cabo el diagnóstico serológico para la detección de anticuerpos tipo IgG anti-Toxocara canis.
Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: placas de poliestireno 96 pozos Immulon I, papel secante, nevera, cronómetro, micropipetas automáticas y puntas, frasco lavador, solución reguladora de revestimiento 0.05 M pH 9.6 (ver anexo 12), solución reguladora de fosfato (PBS, por su sigla en inglés) 0.15 M pH 7.4 (10X) (ver anexo 13), PBS 0.15 M pH 7.4 más Tween 20 (PBS-T20) (ver anexo 14), solución reguladora de dietanolamina pH 9.8 (ver anexo 15), paranitrofenilfosfato e hidróxido de sodio 3N (ver anexo 16).
Condiciones de trabajo utilizadas en Colombia Antígeno secretorio/excretorio
Preparar a partir de cultivos de larvas de Toxocara canis en medio DME (ver anexo 11). La concentración de trabajo estandarizada para ELISA es de 2.5 µg/ml de antígeno.
Suero
La dilución estandarizada de suero es de 1:800, es decir, una parte de suero por 800 partes de solución de trabajo PBS más Tween 20 (PBS-T20) (ver anexo 14). Las muestras problema y los sueros controles positivo y negativo se preparan a esta dilución.
Conjugado (anticuerpo secundario)
La solución de trabajo del conjugado corresponde a anti-IgG humana marcada con fosfatasa alcalina en una dilución de 1:1500, es decir, una parte de conjugado por 1500 partes de solución de trabajo PBS-T20 (ver anexo 14).
Sustrato
El sustrato utilizado es una solución de paranitrofenilfosfato diluido en dietanolamina pH 9.8 (ver anexo 15) en una proporción 1:1 w/v (1 mg de paranitrofenilfosfato diluido en 1 ml de solución reguladora de dietanolamina). La reacción se detiene con NaOH 3N (ver anexo 16).
Punto de corte
Valores de absorbancia mayores o iguales a 0.4 son considerados positivos; valores de absorbancia menores que 0.4 se consideran negativos.
Procedimiento
En la figura 1.2, se esquematiza el procedimiento ELISA indirecto para la detección de anticuerpos tipo IgG anti-Toxocara canis.
Figura 1.2. Procedimiento para la realización de la prueba de ELISA indirecto.
Fuente: cortesía de Olga Lucía Morales Reyes.
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