de materia fecal en el centro de la caja de Petri con el agar.
3. Sellar la caja con papel Parafilm®.
4. Dejar la caja a una temperatura entre 25 °C y 33 °C durante 48 horas.
5. Observar a simple vista o al microscopio.
6. Reportar si se observan canales en el agar.
7. Agregar 10 ml de formol al 10 % y lavar la superficie del agar.
8. Recolectar la suspensión en un tubo y centrifugar a 500 g por 5 minutos.
9. Realizar un montaje directo en solución salina y lugol.
10. Observar al microscopio y reportar los parásitos observados.
Método de Harada-Mori
El fundamento de la técnica es favorecer la embrionación de huevos y la separación de larvas de nemátodos sobre papel de filtro; cuando hay tremátodos y céstodos, se pueden observar los huevos embrionados (16).
Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tubos de ensayo de 16 mm x 15 mm, papel de filtro de 14 cm de largo y 1 cm de ancho, agua destilada estéril, formol al 10 % (ver anexo 3), gradilla, bajalenguas, marcadores, incubadora y centrífuga.
Procedimiento
1. Homogenizar 2 g de materia fecal con 0.5 ml de agua destilada estéril.
2. Con el bajalenguas, esparcir la materia fecal homogenizada sobre los 10 cm centrales de la tira de papel de filtro. Dejar libres 2 cm en cada extremo del papel de filtro.
3. Introducir la tira de papel sembrada en un tubo previamente marcado, que contiene 5 ml de agua destilada estéril; evitar que la zona con la muestra tenga contacto con el agua.
4. Cerrar el tubo y colocarlo en una gradilla.
5. Incubar a 20 °C durante 72 horas.
6. Descartar la tira de papel filtro y agregar 0.5 ml de formol al 10 %.
7. Centrifugar a 500 g por 5 minutos.
8. Realizar un montaje directo en solución salina y lugol.
9. Examinar al microscopio y reportar los parásitos observados.
Diagnóstico de Toxocara canis
El propósito de este aparte es sugerir diferentes metodologías, basadas en fundamentos distintos para realizar el diagnóstico de toxocariasis.
Ensayo inmunoenzimático
La técnica de ensayo inmunoenzemático (ELISA, por su sigla en inglés) permite determinar la concentración del antígeno o del anticuerpo mediante el uso de uno de ellos en fase sólida y el otro en solución; el complejo antígeno-anticuerpo se detecta a través de una enzima que reacciona con su sustrato. Las enzimas más utilizadas son fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa oxidasa y beta-D-galactosidasa. La reacción enzimática se detiene en la fase lineal de la curva con la incorporación de ácidos o bases fuertes, según el tipo de sustrato. La cantidad de producto formado en la reacción se mide en un espectofotómetro, al leer la densidad óptica a la longitud de onda, en la cual el color generado tiene su máxima absorción (17-23).
En Colombia, esta técnica se usa con mayor frecuencia para la búsqueda de anticuerpos. En este caso, el antígeno se fija a la fase sólida y luego se agrega la muestra en la que se sospecha que se encuentra el anticuerpo específico. A continuación, se agrega otro anticuerpo dirigido contra el anticuerpo específico de interés; este segundo anticuerpo está unido o conjugado a la enzima. Finalmente, el sustrato de la enzima se incorpora en la placa, con lo que se produce una reacción colorimétrica que se cuantifica con espectrofotómetro. Durante el proceso de estandarización de la prueba de ELISA, se establece el punto de corte que sirve de referencia para determinar si la muestra analizada es positiva o negativa (17-23).
Obtención de parásitos adultos de Toxocara canis y embrionación de los huevos
La obtención de parásitos adultos y la embrionación de los huevos de Toxocara canis son un procedimiento importante en la producción del antígeno secretor/ excretor usado en la técnica ELISA para la detección de anticuerpos (23). Para la obtención de los adultos de T. canis, se sugiere elegir alguna de las siguientes opciones y llevarla a cabo:
1. Entrar en contacto con centros veterinarios que realicen diagnóstico parasitológico y puedan proporcionar los especímenes una vez los caninos hayan sido sometidos a tratamiento antihelmíntico.
2. Entrar en contacto con centros de zoonosis, a fin de que proporcionen los parasitos adultos de T. canis postratamiento o por procedimientos de necropsia.
3. Infectar caninos experimentalmente con huevos de T. canis bajo condiciones de bioterio y obtener los adultos por procedimientos estandarizados y reglamentados en los protocolos de bioética y bienestar animal establecidos en la normatividad nacional e internacional.
Todos estos procedimientos deben ser realizados por profesionales debida mente capacitados y certificados.
Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: jeringas de 5 ml con su respectiva agua, equipo de disección —es decir, tijeras, pinzas, cuerda o sedade cirugía, etc.–, gasa, papel craft, toallas absorbentes desechables, bolsas para disposición de desechos biológicos, cajas de Petri, guantes quirúrgicos, tapabocas, estereoscopio, jabón antiséptico, microscopio, centrífuga, fiolas de 125 ml, baño serológico a 28 °C, incubadora a 37 °C, termómetro, vasos de precipitado, Tranquilan®, solución de eutanasia (ver anexo 7) y pepsina ácida (ver anexo 8).
Procedimiento
1. Una vez obtenidos los parásitos adultos, colocarlos en solución salina al 0.85 % en un vaso de precipitado.
2. Luego de colectar todos los parásitos, lavarlos con agua corriente varias veces para dejarlos libres de desechos.
3. Colocar los parásitos de nuevo en solución salina al 0.85 % y seleccionar las hembras con ayuda del estereoscopio. Las hembras se caracterizan por ser de mayor longitud y presentar el extremo posterior romo; los machos son más cortos y el extremo posterior termina en una espícula que les confiere una forma puntiaguda.
4. Desechar los machos en bolsas para disposición de desechos biológicos y extraer los úteros grávidos de las hembras. Para ello, asegurar cada hembra con una pinza, cortar ambos extremos del parásito y, con ayuda de otra pinza, hacer presión a lo largo del cuerpo hasta extraer el contenido completo. Depositar los úteros en una solución de pepsina ácida al 1 %.
5. Dejar el material obtenido en agitación magnética a 37 °C por 2 horas.
6. Realizar tres lavados con agua destilada en tubos de centrífuga (aproximadamente 1:10) durante 5 minutos a 100 g.
7. Preparar una solución de formalina al 1 % en fiolas de 125 ml.
8. Mezclar 50 ml de esta solución y 1 ml (aproximadamente)
