inyector en “splitless”, ya que éste permite la entrada de la muestra en su totalidad, a diferencia del inyector en “split” que sólo permite la entrada de la muestra en un porcentaje determinado dependiendo del flujo de venteo con el que se esté trabajando.
Uno de los componentes principales de la CG es la columna y es considerado el corazón del proceso del GC debido a que en la columna ocurre la separación de los componentes presentes en una muestra inyectada. Las columnas capilares comerciales normalmente son tubos de sílica fundida cubiertos externamente con poliamida, conteniendo por dentro la capa de la fase estacionaria. Las columnas empacadas están hechas de vidrio o de metal y por lo general son de 1-3 m de longitud por 2-6 mm diámetro interno. Sin embargo, el uso de este tipo de columnas en ecología química es limitado debido a la baja resolución comparado contra las columnas capilares. Las columnas capilares de 20-30 m largo por 0.25-0.32 mm de diámetro interno son las más comunes para trabajar en CG con buena resolución y tiempos razonables de análisis. Columnas de menor longitud reducen la eficiencia pero pueden ser muy útiles para hacer un análisis preliminar. Por el contrario, columnas de 100 m de largo han sido usadas en aquellos casos en donde se requiere una alta resolución o en el análisis de mezclas complejas. Columnas de más 100 m de largo no son prácticas ya que se eleva mucho la presión dentro de la columna, además de que los tiempos de retención son muy grandes, disminuyendo la eficiencia de la columna. La selección de la fase estacionaria de la columna adecuada depende de las propiedades físicas y químicas del analito a ser separado. Hay dos factores por considerar, primeramente la volatilidad de los compuestos que determinará en términos generales los parámetros como temperatura, grosor de la fase estacionaria requerida para el análisis. En segundo lugar hay que considerar la interacción de los analitos con la fase estacionaria que determinará la separación de los compuestos con volatilidad similar. En este sentido, se sugiere que los compuestos polares pueden resolverse mejor en columnas conteniendo fase estacionaria intermedia o polares. En algunas ocasiones cuando se analizan muestras nuevas que contienen compuestos similares como isómeros se sugiere que el análisis de las muestras se realice en al menos dos columnas diferentes para minimizar la posibilidad de elusión coincidente. Sin embargo, hay casos en donde los compuestos coeluyen y la separación puede ser un problema, como en isómeros E y Z, y en isómeros de cadena larga con la presencia de doble enlace. En este caso, para separar isómeros E de Z se sugiere utilizar una columna de 50-60 m de largo. Los compuestos monoinsaturados pueden ser pobremente resueltos o separados de sus respectivos análogos saturados en columnas conteniendo fase estacionaria no polar, aunque estos compuestos pueden ser separados fácilmente en columnas con fase polar. En términos generales, las columnas con fase no polar tienen ventaja sobre las columnas con fase polar. Hay varias compañías que venden columnas capilares con diferentes fases para ser utilizadas en CG en el análisis de compuestos. Para la selección de la columna, hay que tomar en cuenta los siguientes puntos. Primero, que cada fase estacionaria tiene un máximo y un mínimo de temperatura de trabajo; segundo, la fase no polar es menos susceptible al daño por aire y agua que la fase polar y por lo tanto tienen mas tiempo de vida. La generación de sitios activos en columnas con fase polar puede ser problemático en el análisis de trazas en los que pequeñas cantidades del analito polar dan picos con una pobre o mala resolución, o desapareciendo por completo los picos, dando resultados falsos. Tercero, las columnas con fase no polar muestran mayor eficiencia que las columnas con fase polar, dando picos afinados con una buena forma. Esta ventaja puede hacer la diferencia en aquéllos casos de separaciones difíciles. En ecología química es frecuente que el análisis deberá hacerse en ambas columnas capilares con fase polar y no polar y determinar el índice de Kovats o de retención en ambas columnas en el caso de aquellos compuestos que no están comercialmente disponibles. Otro punto frecuentemente encontrado en ecología química se refiere a la separación de compuestos quirales, que no es posible separarlos con columnas capilares conteniendo la fase estacionaria tradicional, de manera que es necesario utilizar una columna capilar conteniendo una fase quiral (β y γ-ciclodextrina) (Leal et al., 1995). Sin embargo, hay hidrocarburos alifáticos quirales que son difíciles de separar debido a la falta de un grupo funcional para ser derivatizado para formar diastereoisómeros (Meierhenrich et al., 2003), aunque recientemente los estereoisómeros del 7,11-dimetilheptadecano fueron separados usando una columna capilar conteniendo una fase de ciclodextrina modificada (Chow et al., 2004), abriendo la posibilidad para caracterizar feromonas constituidas por hidrocarburos ramificados. Otro componente importante de la CG son los detectores, existen varios tipos de detectores. Sin embargo, los detectores más utilizados en ecología química son el DIF y el detector de espectrometría de masas (EM), teniendo este último buena sensibilidad, del orden de los picogramos.
Hay algunos factores que afectan la buena separación de los picos CG como la volatilidad de los analitos, volatilidad del disolvente, la concentración, diámetro de la columna, el grosor de la fase estacionaria y la temperatura inicial de la columna. El proceso de inyección de la muestra deberá minimizar la pérdida por descomposición o por absorción. En este punto es crucial le selección del disolvente, ya que el volumen de vapor generado durante la inyección de un volumen dado de diferentes disolventes no es el mismo, pero es dependiente del peso molecular y de la densidad del disolvente. Además, ese volumen generado es dependiente de la presión de cabeza de la columna, que depende del diámetro y la longitud de la columna y del gas de arrastre usado. En ese sentido, disolventes densos de bajo peso molecular como el agua y el metanol, crean grandes volúmenes de vapor. Otros factores que deben ser considerados son la compatibilidad del disolvente con el detector, el punto de ebullición del disolvente y la compatibilidad del disolvente con la fase estacionaria de la columna.
Cromatografía de gases-espectrometría de masas
Sin lugar a dudas la CG acoplada a espectrometría de masas (EM) es la técnica más usada en la identificación de semioquímicos, esta técnica combina las características de la CG con la EM para identificar compuestos presentes en una muestra. Para aquéllos interesados en conocer más sobre espectrometría de masas, pueden consultar McLafferty & Turecek (1993). El uso de un espectrómetro de masas como un detector de un cromatógrafo de gases fue desarrollado en 1950 por Roland Gohlke & Fred McLafferty. El espectrómetro de masas más comúnmente asociado a un cromatógrafo de gases es el llamado cuadropolo o detector selectivo de masas. Otro analizador bastante utilizado es de la trampa de iones. Otros analizadores menos usados, principalmente por sus altos costos, son el de sector magnético y el de tiempo de vuelo. En general, la técnica consiste en separar los compuestos por medio de la CG y conforme son separados, enviados al espectrómetro de masas, en donde los compuestos son ionizados mediante impacto de electrones y fragmentados. Los iones son separados en función de la relación masa/carga y la abundancia relativa de cada ion es registrada como el espectro de masas. Otra alternativa de ionización en fase gaseosa es mediante la ionización química, con este procedimiento es posible obtener el ion molecular que proporciona el peso molecular de un compuesto determinado.
El patrón de fragmentación de un compuesto se ajusta a un patrón similar correspondiente al grupo que pertenece y ésta es la información básica para la identificación de un compuesto. En la actualidad los nuevos equipos de GC-MS incluyen una base de datos (NIST) que contiene más de 200,000 espectros de masas del mismo número de compuestos. El espectro de masas obtenido de un compuesto determinado es comparado contra los compuestos de la base de datos y de esta manera la base de datos sugiere una identificación tentativa que deberá ser confirmada. Las identificaciones tentativas son confirmadas por comparación de los datos espectrales y de los tiempos de retención con aquéllos de estándares auténticos. En los casos en donde no se cuenta con los estándares, se calcula el índice de Kovats para cada compuesto y de esta forma se aproxima uno a la identificación. Otra posibilidad de confirmar la identificación cuando se cuenta con el sintético consiste en una co-inyección de una cantidad determinada del compuesto conocido y si es el compuesto es el correspondiente, entonces el área del pico en la muestra será mayor.
Otras técnicas de espectrometría de masas
La espectrometría de masas por reacción de transferencia de protones (PTR-MS
