directamente al DIF). Sin embargo, este conector tiene el inconveniente de ser bastante caro y su mantenimiento se debe hacer cuidadosamente ya que este dispositivo consiste de una pequeña aguja de acero inoxidable que se abre o se cierra, dependiendo de la relación que se quiera tener DIF: EAD. Una alternativa es utilizar un conector (Fixed Outlet Splitter) con una tasa de separación fija de 1:1, 1:5, o 1:10 al detector 1:detector 2. Este separador se coloca dentro del horno del CG, tiene la ventaja de no requerir el segundo “make-up”, ya que funciona solamente con el gas de arrastre, por lo tanto, el análisis de muestras usando este conector es más económico. Este dispositivo consiste en un par de tuercas (una macho y otra hembra), cuyo interior contiene una férula de grafito que tiene en un extremo un pequeño agujero por donde se conecta la parte final de la columna capilar y en el otro extremo de la férula tiene dos agujeros en donde se insertan las líneas de transferencia, una para el DIF y la otra para el EAD.
La gran ventaja de la CG-EAD es que discrimina selectivamente aquellos picos del extracto que no tienen actividad antenal y sugiere compuestos candidatos a ser evaluados en pruebas comportamentales y de campo. La CG-EAD ha demostrado ser una herramienta invaluable en la identificación de feromonas y atrayentes de insectos de diferentes órdenes. Sin duda alguna que la CG-EAD es la técnica más utilizada en la identificación de semioquímicos comparada con los métodos tradicionales. Por ejemplo, en una revisión de los artículos publicados en el Journal of Chemical Ecology sobre la identificación de feromonas y atrayentes de insectos en los últimos años (2000-2005), de un total de 1167 artículos publicados, se encontró que el 55% reportaron haber utilizado CG-EAD, siendo lepidópteros y coleópteros los más estudiados. En nuestro laboratorio hemos desarrollado la CG-EAD que ha sido de gran utilidad en la identificación de la feromona sexual de Copitarsia decolora (Rojas et al., 2006), la feromona de agregación del picudo del agave, Scyphophorus acupuctatus (Ruiz-Montiel et al., 2008) y en la búsqueda de posibles atrayentes para moscas de la fruta a partir de volátiles aislados de frutos de hospederas (Malo et al., 2005; Cruz-López et al., 2006).
Después de determinar los picos con actividad antenal, el paso siguiente consiste en la identificación química de esos picos por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM). Sin embargo, hemos observado que el tiempo de retención de los picos obtenidos por GC-EAD es ligeramente mayor que los de GC-MS, esto debido a que GC-EAD trabaja a alta presión por el flujo de los gases que utiliza, y el CG-EM opera a alto vacío, por lo que no es fácil acoplar ambos equipos. En este sentido, Weisbecker et al. (2004) reportaron el primer equipo CG-EAD-EM, que permite determinar los picos con actividad antenal y simultáneamente identificarlos por CG-EM. Los autores identificaron los compuestos volátiles de la papa que fueron antenalmente activos al escarabajo de la papa, Leptinotarsa decemlineata.
Cromatografía de gases-Registro unicelular (CG-RUC)
En algunas ocasiones la técnica CG-EAD no permite ver la respuesta antenal a los compuestos de un determinado extracto debido a que existen pocos receptores en la antena del insecto y entonces la CG-RUC se convierte en un suplemento de la CGEAD. El primer acoplamiento de CG y RuC fue logrado independientemente por Wadhams (1982) trabajando con el descortezador Scolytus scolytus, y por Van Der Pers & Lofstedt (1983) trabajando con la palomilla Agrotis segetum. En esta técnica el efluente de la columna del CG es detectado simultáneamente por el DIF del CG y la neurona olfativa del insecto. El uso de CG-RUC ha permitido determinar los receptores de la feromona y volátiles de hospedera y de no-hospedera (Tømmerás & Mustaparta, 1987; Wibe et al., 1997; Bichao et al., 2005). Por ejemplo, en el escarabajo descortezador Ips typographus, la respuesta a los olores de la corteza fue estudiada por CG acoplada a registros electrofisiológicos de células receptoras olfativas, y se encontraron cuatro fracciones menores pertenecientes a dos extractos que excitaban células receptoras olfativas. La respuesta de las células fue dividida en dos grupos principales reaccionando exclusivamente a una fracción, sugiriendo que las células fueron altamente especializadas a un olor de la hospedera particular. Sin embargo, un extracto efectivo o fracción no pudo ser encontrada para la mitad de las unidades olfatorias respondiendo a la corteza natural, sugiriendo que posiblemente los compuestos activos relevantes fueron perdidos durante la extracción y/o CG (Tømmerás & Mustaparta, 1987). En este mismo sentido, Bichao et al. (2005) estudiaron las neuronas receptoras de la antena del picudo Anthonomus rubi a compuestos producidos por la planta de fresa usando CG acoplada a registro unicelular. Reportaron la presencia de cinco tipos de neuronas receptoras olfativas, identificadas de acuerdo con un olor primario, por ejemplo, el compuesto al cual las neuronas son más sensitivas. Los compuestos identificados fueron (-)-germacrene d, (-)-ß-cariofileno, salicilato de metilo, (E)-ß-ocimeno y (3E)-4,8-dimethil-1,3,7-nonatrieno, que están presentes en la planta de fresa, y fueron producidos en grandes cantidades cuando los picudos estaban alimentándose.
Identificación química
Cromatografía de gases
La CG es una de las técnicas más utilizadas en el análisis de compuestos volátiles con una fuerte aplicación en la industria petroquímica, farmacéutica, plástico, pinturas, agroquímicos y de alimentos, entre otras. El uso de la CG en la separación y aislamiento de semioquímicos de insectos se remota a los años 60. Las ventajas de la CG para el análisis de compuestos volátiles y semivolátiles son: 1) tiene alta resolución, ya que más de 100 compuestos pueden ser separados en una sola corrida; 2) la CG es simple, rápida, flexible, robusta, y relativamente es un método barato que puede ser usado rutinariamente con un mínimo de entrenamiento; 3) el detector DIF, es bastante sensitivo (10-100 picogramos) y universal, permitiendo la detección de todos los compuestos de una extracto; 4) los índices de retención (tiempo de retención relativos) son reproducibles entre diferentes instrumentos y laboratorios, constituyéndose en una valiosa herramienta para la identificación de compuestos; y 5) un equipo de CG puede trabajar por décadas (Heath & dueben, 1998).
Los componentes básicos de la CG son: un cilindro conteniendo el gas de arrastre y su regulador de flujo. El horno que es donde se encuentra la columna, considerada el corazón del equipo, ya que en la columna es donde ocurre la separación de los componentes de la muestra. En un extremo la columna se conecta al inyector, que es una pequeña cámara que permite la entrada de la muestra a la columna. El otro extremo de la columna se conecta al detector, que es un sistema que convierte la señal química obtenida en el análisis en señal eléctrica. Esta señal eléctrica puede ser plasmada en un registrador o en un integrador. Los equipos modernos incorporan una computadora desde la cual se controla el funcionamiento del aparato, análisis, y edición y se imprime o se guarda la información del análisis.
El gas de arrastre funciona como fase móvil y contribuye al desplazamiento de los componentes de la muestra a través de la columna hacia el detector. La selección del gas de arrastre es un punto importante ya que no deberá ser reactivo, no-tóxico, no-flamable, y en la medida de lo posible no debe ser caro. Los gases más comúnmente utilizados son hidrógeno, helio y nitrógeno. El nitrógeno a flujo lento, permite obtener una buena eficiencia cromatográfica. Sin embargo, la eficiencia del nitrógeno decrece cuando se incrementa o disminuye el flujo, y esto origina prolongados tiempos de permanencia en el inyector y en la columna, con la posibilidad de causar degradación térmica a algún componente de la muestra. Estos factores contribuyen a que el nitrógeno sea calificado como no apropiado como gas acarreador, a pesar de su bajo costo. El hidrógeno no es caro y tiene excelentes propiedades cromatográficas, sin embargo, la mayor desventaja es su alta flamabilidad, haciendo indispensable que el flujo del “split” y de purga sean expulsados hacia fuera del laboratorio. El helio representa una buena opción, ya que aunque es más caro que los otros gases, no es explosivo y proporciona una buena resolución cromatográfica. Debido a que el helio es completamente inerte, no hay posibilidad de reacción con el analito.
El inyector es una pequeña cámara en donde se volatiliza la muestra líquida disuelta en un disolvente para ser arrastrada hacia la columna. Existen varios tipos de inyectores: “on-column”,
