Ergebnisse sprechen dafür, dass unser Ansatz die Diagnose von ALB aus Nagespänen und Fraß ermöglicht?
Vergleichende Analysen mit Anoplophora chinensis (Citrusbockkäfer, kurz CLB; eng mit ALB verwandte Art) und anderen Insekten belegen, dass unser Protokoll hochspezifisch für den Nachweis des ALB ist. Der Vergleich von ALB-Nagespänen und Kontrollen sollte in etwa das in Abbildung 6 dargestellte Ergebnis liefern: gBlocks (synthetische Nukleotide) der ALB-Zielsequenz werden schon in frühen qPCR-Zyklen (links im Diagramm) nachgewiesen, Positivkontrollen aus Larven-DNA etwas später (weiter rechts im Diagramm) und Negativkontrollen gar nicht (Abbildung 6D). ALB-DNA aus Nagespänen ist gemäß dem Anteil enthaltener, noch nicht degradierter Kopien des Ziel-Gens entweder schon kurz nach den ALB-Positivkontrollen oder entsprechend später nachweisbar (Abbildung 6E). Natürlich kann nicht ausgeschlossen werden, dass die DNA in sehr alten Nagespänen so weit degradiert ist, dass überhaupt keine intakte Kopie der Ziel-Region mehr vorliegt.
Abbildung 6: Abwiegen genau definierter Mengen des Ausgangsmaterials (A), Verdünnungsreihen des Ausgangsmaterials zur Bestimmung der Nachweisgrenze (B); der qTOWER von Analytik Jena, einer von mehreren geeigneten qPCR-Thermocyclern (C); DNA-Amplifizierungs-Plot von ALB-Positiv- und Negativkontrollen (D); DNA-Amplifizierungs-Plot von ALB-DNA aus Nagespänen (E)
Durch Verwendung genau definierter Mengen unterschiedlichen Ausgangsmaterials und Verdünnungsreihen bis jenseits der Nachweisgrenze konnten wir zeigen, dass die von uns entwickelten Primer und Sonden einen zuverlässigen, hochsensitiven und spezifischen Nachweis von ALB aus Nagespänen ermöglichen.
5 Diskussion
5.1 Warum wird zum spezifischen Nachweis von Schadorganismen noch immer das konservierte COI-Gen verwendet?
Grundsätzlich wäre es wünschenswert, vergleichende Genomstudien von ALB und anderen Insekten durchzuführen, um einzigartige, ALB-spezifische Gene zu finden und somit falschpositive Ergebnisse mit absoluter Sicherheit ausschließen zu können. Leider ist aber die Anzahl komplett sequenzierter Insektengenome noch immer sehr gering und folglich eine Aussage zu einzigartigen ALB-Genen gar nicht möglich. Deshalb ist es ratsam, mit denjenigen Genen zu arbeiten, die bei möglichst vielen verschiedenen Insektenarten sequenziert wurden, also bspw. dem COI-Gen. Da dieses Gen nicht auf ganzer Länge hochkonserviert ist, sondern auch sehr variable Regionen besitzt (LUNT et al. 1996), lassen sich ALB-spezifische Sequenzabschnitte finden, für die man Primer und TaqMan-Sonden designen kann.
5.2 Welchen Vorteil hat die qPCR gegenüber herkömmlichen PCRs?
Die quantitative PCR (qPCR) hat gegenüber der herkömmlichen PCR drei große Vorteile:
1.) Sensitivität: auch sehr geringe DNA-Mengen können zuverlässig nachgewiesen werden,
2.) Spezifität: die Gefahr falschpositiver Ergebnisse durch Amplifizierung von nicht-ALB DNA kann durch Zugabe einer sogenannten TaqMan-Sonde, eines kurzen Fluoreszenzfarbstoff-markierten Nukleotids, deutlich reduziert werden und
3.) eine deutlich geringere Länge der Ziel-DNA (der Barcoding-Bereich des COI-Gens umfasst >700 bp verglichen mit weniger als 200 bp, die für die qPCR notwendig sind) erhöht die Wahrscheinlichkeit, ALB auch anhand teilweise degradierter DNA nachzuweisen.
Die TaqMan-Sonde ist genau wie die qPCR-Primer hochspezifisch für die Ziel-DNA. Die gemessene Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu und kann noch sicher detektiert werden, wenn erst in späten PCR-Zyklen der erforderliche Grenzwert überschritten wird.
5.3 Welche Kontrollen sind erforderlich, um ALB mittels qPCR nachzuweisen?
Um eine Kontamination der Probe während der DNA-Extraktion und der qPCR ausschließen zu können, müssen Negativ- und Positivkontrollen als Referenzen in der qPCR mitlaufen. Um Verwechslungen von ALB mit anderen Insekten auszuschließen, sind als Negativkontrollen die DNA-Extrakte nahverwandter Organismen zu überprüfen. Nur wenn diese auch bei späten qPCR-Zyklen keine Vervielfältigung ihrer DNA zeigen (Abbildung 6), sind die experimentell bestimmten Rahmenbedingungen (wie bspw. die Sequenz von Primer- und TaqMan-Sonden oder das Thermocycler-Profil) ausreichend spezifisch. Als Positivkontrolle sind nicht nur fertig extrahierte ALB-Larvenproben unbedingt erforderlich, sondern auch ALB-Nagespäne, an denen zuvor bereits erfolgreich ALB nachgewiesen wurde. Synthetische Nukleotide der ALB-Zielsequenz (gBlocks) können optional als zusätzliche Positivkontrolle verwendet werden.
5.4 Auswirkungen des neuen Verfahrens auf die Arbeit der Baumpfleger und Pflanzenschutzdienste
Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche ALB-Diagnose ist nun nicht mehr das Aufspüren von ALB-Entwicklungsstadien wie Eier und Larven, sondern das Auffinden von möglichst frischem Fraß bzw. frischen Nagespänen. Ein großer Vorteil der neuen qPCR-basierten Methode ist, dass sie viel schneller ist als der Nachweis mittels EPPO Standard PM 7/129, welcher eine Sequenzierung der Ziel-DNA erfordert. Die Sequenzierung ist bei Einsendung an externe Dienstleister mit einer zwei- bis dreitägigen Wartezeit auf die Ergebnisse verknüpft, das qPCR-Ergebnis hingegen erhält man bereits nach einer Stunde. Dank dieser Vorgehensweise ist die ALB-Diagnose nunmehr schnell und jahreszeitenunabhängig möglich. Baumpfleger können mit der neu entwickelten Methode durch Versenden von Probenmaterial an die zuständigen Pflanzenschutzdienste der Länder Informationen über die Art des Schaderregers auch in Abwesenheit lebendiger Entwicklungsstadien einholen.
6 Ausblick
Im Zuge der Ausweitung dieses Diagnoseverfahrens auf andere invasive holzbewohnende Insekten mittels entsprechender spezifischer Primer und Sonden kann der Einsatzbereich in der Baumpflege in Zukunft noch erweitert werden.
Dank
Wir danken der Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. für die Finanzierung des ANOPLO-diag Projekts.
Literatur
EFSA (European Food Safety Authority); HOPPE, B.; SCHRADER, G.; KINKAR, M., VOS, S., 2019: Pest survey card on Anoplophora glabripennis. EFSA Supporting Publications, 16(12).
EPPO, 2016: PM 7/129 (1) DNA barcoding as an identification tool for a number of regulated pests. EPPO Bulletin, 46(3), 501–537.
EU, 2015: Durchführungsbeschluss (EU) 2015/893 der Kommission über Maßnahmen zum Schutz der Union gegen die Einschleppung und Ausbreitung von Anoplophora glabripennis (Motschulsky). Amtsblatt der Europäischen Union, 9. Juni 2015: L 146/16, Aktenzeichen C(2015) 3772.
HOPPE, B.; WILSTERMANN, A.; BECKER, M.; FORNEFELD, E.; SCHRADER, G.; SCHRÖDER, T., 2020: Quarantäneschadorganismen in Gehölzen – was hat sich verändert, was kommt auf uns zu? In: DUJESIEFKEN, D. (Hrsg.): Jahrbuch der Baumpflege 2020. Haymarket Media, Braunschweig, 32–44.
